骨髓間充質干細胞及其分泌因子對治療犬股骨頭缺血性壞死的效果觀察

汪 逸，張媛媛，黃紹義，汪迪飛，李素華，汪登如，鄭小波

(1.華中農業大學動物科學技術學院動物醫學院，湖北 武漢 430070；2.西南大學動物科技學院，重慶 榮昌 4024602；3.云南研靈生物科技有限公司，云南 昆明 650201；4.西南林業大學生命科學院，云南 昆明 650224)

1 材料

1.1 試驗犬只 26只健康雜種犬，雌雄不限，年齡在8～12月齡，體重6～8 kg，術前經DR檢查，雙側股骨頭均正常。

1.2 試驗試劑 犬骨髓間充質干細胞(BMSCs)、犬骨髓間充質干細胞分泌因子(BMSCs-cm,云南研靈生物科技有限公司)、舒泰、H.E.染色試劑等。

1.3 試驗儀器 動物手術器械、高壓滅菌鍋、DR攝片機、顯微鏡等。

2 方法

2.1 動物分組 26只試驗犬隨機分成4組，A組為單純造模組(8只)，B組為髓芯減壓治療組(6只)；C組為骨髓間充質干細胞分泌因子治療組(6只)；D組為骨髓間充質干細胞移植治療組(6只)。

2.2 犬股骨頭缺血性壞死模型的建立 按無菌操作原則進行手術，依次顯露股骨頭，不切斷圓韌帶，髖關節不脫位，用棉簽蘸取液氮，連續冷凍股骨頭15次，持續3 min，再用37 ℃溫生理鹽水復溫3 min，如此循環2次，造成局部冷熱交替損傷。最后用生理鹽水沖洗術區，逐層縫合切口，碘伏涂抹皮膚切口兩側。

2.3 骨髓間充質干細胞及其分泌因子移植 B、C、D 組的股骨頭第2次復溫后，不關閉切口，均從股骨頸向股骨頭鉆入導針至軟骨下骨，確認方向深度后，用骨科電鉆將直徑4.0 mm的導針鉆到軟骨下2.0～3.0 mm處，將孔內殘留的組織清除干凈。B組(髓芯減壓治療組)，一共植入3 mL生理鹽水，鉆孔后，孔內植入明膠海綿，注入0.1 mL生理鹽水，隨即逐層關閉切口，再把2.9 mL的生理鹽水向關節腔里分點注射，最后縫合皮膚，碘伏涂抹皮膚切口兩側；C組(骨髓間充質干細胞分泌因子治療組)，一共植入3 mL的BMSCs-CM，鉆孔后，孔內植入明膠海綿，先注入0.1 mL的BMSCs-CM，隨即逐層閉合切口，再把2.9 mL的BMSCs-CM向關節腔里分點注射，最后縫合皮膚，碘伏涂抹皮膚切口兩側；D組(骨髓間充質干細胞移植治療組)，一共植入1 mL的BMSCs，鉆孔后，孔內植入明膠海綿，先注入0.1 mL的BMSCs，隨即逐層閉合切口，再把0.9 mL的BMSCs向關節腔里分點注射，最后縫合皮膚，碘伏消毒。

2.4 術后護理 術后為了預防感染，給試驗犬佩戴伊麗莎白圈，防止舔咬，肌肉注射氨芐西林鈉0.5 g/只，用碘伏對切口進行消毒，持續7 d。

2.5 檢測內容和方法

2.5.1 一般情況觀察 觀察試驗動物的精神狀態、進食、切口愈合情況、活動量及有無跛行等情況。

2.5.2 DR影像學檢查 A組于術后3、7、21、42、63 d；B、C、D三組分別于術后21、42、63 d進行DR髖關節正位檢查，試驗動物仰臥于攝片床，四肢外展并用繩子固定于攝片床沿，隨后進行DR拍攝。觀察股骨頭DR影像變化，對DR影像進行定性評價，包括股骨頭外形、骨密度、是否出現塌陷。

2.5.3 股骨頭病理組織學觀察 股骨頭標本經過固定，脫鈣，沖洗，脫水，透明，石蠟包埋，切片等處理，最后進行染色封片，H.E.染色。觀察股骨頭軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、骨髓組織的變化情況；骨小梁形態結構、排列的變化及有無斷裂等情況；空骨陷窩的數量變化情況，缺損區內的變化情況。空骨陷窩計數測定：400倍視野下，每一標本H.E.染色切片中，共計數200個骨陷窩，測定空骨陷窩所占百分比，空骨陷窩率=空骨陷窩數/總骨陷窩數。

3 結果與分析

3.1 一般情況觀察 所有的試驗動物生理狀態均正常，術后7 d拆除縫合線，傷口愈合良好。造模組(A組)，術后2 d內，造模側均回縮呈懸掛狀態，不敢下地行走，偶有點地行走，之后一直跛行；術后7 d左右，大多數動物的運動量、步態基本恢復正常，跛行不明顯。髓芯減壓治療組(B組)，運動情況跟A組動物表現基本相同。骨髓間充質干細胞分泌因子治療組(C組)，動物在術后1 d，術肢不能著地，術后2 d開始點地行走，但運動量也不大，之后一直處于跛行狀態；術后5 d左右，運動量、步態基本恢復正常。骨髓間充質干細胞移植治療組(D組)，動物在術后1 d，術肢可以點地行走，運動量不大，但是比起A、B組動物，運動情況要好；于術后4 d左右，運動量、步態基本恢復正常。

3.2 DR影像學檢查 A 組在術后的3 d、7 d，分別進行髖關節正位DR檢查，試驗側(箭頭所指)股骨頭外形近似圓形、密度均勻，無異常改變(圖1、圖2)。

圖1 A組股骨頭DR影像 (術后3 d)

圖2 A組股骨頭DR影像 (術后7 d)

在術后21 d，A、B、C、D四組分別進行髖關節正位DR檢查，試驗側(箭頭所指)股骨頭外形正常，鉆孔區域外密度與正常側無明顯異常，B、C、D三組鉆孔區域內密度均明顯降低(圖3)。

圖3 各組股骨頭DR影像 (術后21 d)

a： A組；b： B組；c： C組；d： D組

在術后42 d，A、B、C、D四組分別進行髖關節正位DR檢查，試驗側(箭頭所指)股骨頭外形正常，鉆孔區域外密度均有所升高，B、C、D三組鉆孔區域內密度均在逐漸升高，其中D組可見缺損面積有所減少(圖4)。

在術后63 d，A、B、C、D四組分別進行髖關節正位DR檢查，試驗側(箭頭所指)股骨頭外形正常；A組股骨頭密度明顯增高，密度不均勻；B組鉆孔區域外，密度明顯增高，鉆孔區域內邊緣密度增高，中心密度還是較低，缺損面積基本沒有改變；C、D兩組鉆孔區域外，密度均明顯增高，C組鉆孔區域內密度明顯增高，缺損面積減少，D組鉆孔區域內密度明顯高，缺損面積明顯減少，只存在少量的缺損區域(圖5)。

3.3 病理組織學觀察 A組術后7d，冷凍處軟骨細胞出現壞死，核固縮或核溶解；此時骨小梁的形態、排列正常，但是有較多空骨陷窩(見中插彩版圖6)。

圖4 各組股骨頭DR影響 (術后42 d)

a： A組；b： B組；c： C組；d： D組

圖5 各組股骨頭DR影響 (術后63 d)

a： A組；b： B組；c： C組；d： D組

A組術后21 d，骨小梁有較多空骨陷窩出現，骨小梁變細，部分發生斷裂，排列無規則，骨小梁周圍出現纖維組織，髓腔內有充血、出血，脂肪細胞增大，有部分融合現象(見中插彩版圖7)。

B組術后21 d，在鉆孔區域外的病理變化大致跟A組相似。在鉆孔區域內，邊緣出現較多成骨細胞，并且已有類骨質和少量幼稚骨小梁出現，鉆孔區域中間有少量的成骨細胞(見中插彩版圖7)。

C組術后21 d，在鉆孔區域外，骨小梁的壞死程度輕于A、B兩組，修復反應明顯強于A、B兩組，雖然骨小梁空骨陷窩有所增多，骨小梁變細，但是沒有斷裂現象，排列較規則，可見較多的骨小梁被增生的纖維組織包繞著，髓腔內脂肪細胞增多；鉆孔區域內，有較多幼稚的骨小梁和類骨質生成，還有大量的成骨細胞，開始有骨髓組織形成(見中插彩版圖7)。

D組術后21d，在鉆孔區域外病理變化與C組相似，在鉆孔區域內形成的幼稚骨小梁較C組更粗大、排列更緊密，出現了較多的骨髓組織(見中插彩版圖7)。

A組術后42 d，骨小梁空骨陷窩增多，發生斷裂，排列紊亂，骨小梁周圍出現纖維組織爬行替代，有少量新生類骨質形成，髓腔周圍出現死骨碎片，脂肪細胞增大、彌散(見中插彩版圖8)。

B組術后42 d，在鉆孔區域外，骨小梁空骨陷窩增多，骨小梁斷裂現象不嚴重，排列紊亂，骨小梁周圍出現纖維化骨匍行附著，有較多新生類骨質形成，髓腔周圍出現少量死骨碎片，脂肪細胞增大、彌散；在鉆孔區域內，邊緣幼稚骨小梁增多，開始出現骨髓組織(見中插彩版圖8)。

C組術后42 d，在鉆孔區域外，骨小梁空骨陷窩比21 d有所減少，骨小梁周邊有少量新生骨形成，脂肪細胞減少；在鉆孔區域內，邊緣有大量骨小梁趨于成熟，中央區域有較多新生骨小梁，有較多骨髓組織出現(見中插彩版圖8)。

D組術后42 d，在鉆孔區域外，骨小梁空骨陷窩比21 d有所減少，骨小梁周邊有較多新生骨形成，骨小梁增粗，脂肪細胞減少；在鉆孔區域內，有大量骨小梁趨于成熟，骨髓組織豐富(見中插彩版圖8)。

A組術后63 d，骨小梁內有大量空骨陷窩，稀疏變細，碎裂嚴重，髓腔周圍較多骨碎片，可見新骨沉積性生長(見中插彩版圖9)。

B組術后63 d，在鉆孔區域外，骨小梁空骨陷窩減少，周圍有部分新骨形成；在鉆孔區域內，出現較多未成熟的骨小梁，邊緣區骨小梁趨于成熟，有較多骨髓組織出現(見中插彩版圖9)。

C組術后63 d，在鉆孔區域外，骨小梁空骨陷窩明顯減少，周圍有較多新骨形成，骨小梁增粗，脂肪細胞減少；在鉆孔區域內，里面已填充著大量的成熟骨小梁和骨髓組織及少量新生骨小梁(見中插彩版圖9)。

D組術后63 d，在鉆孔區域外，骨小梁空骨陷窩明顯減少，周圍有較多新骨形成，骨小梁明顯增粗，脂肪細胞減少；在鉆孔區域內，骨小梁較寬，排列緊密，可見骨小梁成熟和髓腔形成(見中插彩版圖9)。

術后63 d，A組：軟骨層內，軟骨細胞壞死嚴重，軟骨面剝脫；B組：軟骨層內，軟骨細胞壞死嚴重，軟骨面未出現剝脫；C組：軟骨層內，部分軟骨細胞出現核固縮現象，軟骨面未出現剝脫；D組：軟骨層內，軟骨細胞，核較大，位于中央，趨于正常(見中插彩版圖10)。

3.4 空骨陷窩率計算結果 術后21、42、63 d，A模型組逐漸升高，B治療組先升高后下降，C、D兩治療組均逐漸下降。在術后21 d，模型組與3組治療組比較，空骨陷窩率均差異不顯著(P>0.05)；在術后42 d，A模型組與B治療組比較差異不顯著(P>0.05)，與C治療組比較差異顯著(P<0.05)，與D治療組比較差異極顯著(P<0.01)；在術后63 d，A模型組空骨陷窩率最高，與B治療組比較差異顯著(P<0.05)，與C、D兩治療組比較均差異極顯著(P<0.01)。B、C、D三組治療組進行比較，在術后21 d，空骨陷窩率均差異不顯著(P>0.05)；在術后42 d，B、C兩組比較差異不顯著(P>0.05)，B、D兩組比較差異顯著(P<0.05)，C、D兩組比較差異不顯著(P>0.05)；在術后63 d，B、C兩組比較差異顯著(P<0.05)，B、D兩組比較差異顯著(P<0.05)，C、D兩組比較差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 術后各組空骨陷窩率比較

注：與A組比較，*:P<0.05，**:P<0.01; 與B組比較，#:P<0.05

4 分析與討論

4.1 犬股骨頭缺血性壞死模型的建立 股骨頭缺血性壞死(Avascular necrosis of the femoral head,ANFH)是一種常見的骨科疾病，又稱為股骨頭壞死或股骨頭無菌性壞死，主要是由于各種病因破壞了股骨頭的血供，造成股骨頭部分甚至完全缺血，從而引起骨的活性成分(骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞)死亡[1]液氮造模屬于非創傷方式，常用液氮冷凍股骨頭后再復溫，液氮冷凍股骨頭作用快，可直接損傷骨細胞，引起血管痙攣，誘發髓腔出血；再用溫生理鹽水復溫，引起缺血再灌注損傷，雙重作用加重對細胞的損傷[2]。

4.2 術肢運動機能恢復情況 犬髖關節作為犬全身最重要的負重關節，是連接軀干與下肢的球窩多軸關節[3]。本試驗4組犬經過手術后，術后1 d，造模組、髓芯減壓組的所有犬術肢回縮，呈懸垂狀態，均不能著地，而BMSCs-CM治療組有1只犬可以著地，BMSCs治療組有5只犬可以著地；術后2 d，造模組僅有2只犬可以點地行走，髓芯減壓組有3只犬可以點地行走，而BMSCs-CM治療組有5只犬可以點地行走，BMSCs治療組的6只犬全部可以點地行走；造模組、髓芯減壓組于術后3 d，各有2只犬可以全負面著地行走，而BMSCs-CM治療組、BMSCs治療組各自的6只犬均可以全負面著地行走。造模組、髓芯減壓組犬于7 d后，BMSCs-CM治療組犬于5 d左右、BMSCs治療組犬于4 d左右，步態和運動量基本恢復正常。

4.3 DR結果分析 本試驗采用了DR進行股骨頭影像學檢測，造模組、髓芯減壓治療組、BMSCs-CM治療組、BMSCs治療組，在術后21 d、42 d、63 d，冷凍區域密度均在逐漸升高，這點與文獻報道的早期ANFH表現為股骨頭承重區斑片狀骨質硬化，呈局限性片狀高密度灶表現一致[4]。牛敬才等[5]在21 d 時就已經觀察到試驗側股骨頭骨密度有所增加，而本試驗在42 d時才發現試驗側股骨頭密度有所增加，這可能是由于我們采用的是棉簽蘸取液氮冷凍，范圍有限，而他們采用漏斗傾倒液氮的方式，壞死程度和范圍更廣，修復距離增加。

4.4 股骨頭大體形態分析 本試驗在術后63 d，造模組出現了軟骨剝脫情況，表面粗糙且色澤暗黃，說明骨內有明顯的出血現象，壞死嚴重，髓芯減壓治療組、BMSCs-CM治療組、BMSCs治療組在術后63 d，都沒有出現軟骨剝脫的情況，與造模組相比，股骨頭冷凍處的顏色較造模組淺，表面也沒有那么粗糙。說明3種治療措施都延緩了股骨頭壞死的進程，但是髓芯減壓治療組股骨頭表面粗糙且顏色泛黃情況較BMSCs-CM治療組、BMSCs治療組嚴重，說明髓芯減壓對股骨頭壞死治療效果不佳，而BMSCs-CM和BMSCs對股骨頭壞死治療效果明顯。

4.5 組織病理切片結果分析 股骨頭的病理組織學特征是最直觀、最準確的判斷股骨頭壞死的指標。其病理組織學判定標準可歸納為以下4點:(1)骨髓造血成分凋亡，脂肪細胞水腫、變性；(2)骨髓脂肪網狀壞死；(3)骨小梁變薄、斷裂和完全壞死；(4)在壞死的骨髓及骨小梁周圍，有纖維組織或類新骨組織形成[6]。

4.6 空骨陷窩率結果分析 除了病理組織學判斷標準外，骨細胞的狀態也能作為診斷骨壞死的重要依據，骨細胞是骨組織的重要構成部分，它由成骨細胞轉變而來，被包埋在骨陷窩中[7]；經骨髓間充質干細胞治療后，相對于造模組空骨陷窩率顯著下降。

髓芯減壓、骨髓間充質干細胞、骨髓間充質干細胞分泌因子對犬股骨頭缺血性壞死都有一定的治療效果；髓芯減壓可以減緩股骨頭缺血性壞死的進程，但是在治療早期效果并不明顯；骨髓間充質干細胞及其分泌因子可以促進成骨細胞增殖分化，加速股骨頭內血運恢復，對治療犬股骨缺血性壞死效果明顯，但是由于骨髓間充質干細胞治療組是直接增加了壞死區內的干細胞數量，而骨髓間充質干細胞分泌因子組并不會立即增加壞死區內干細胞數量[8]，它促進內源性干細胞的增殖分化也需要一定時間，所以骨髓間充質干細胞治療組較骨髓間充質干細胞分泌因子組要先發揮成骨作用，能更早地促進骨的修復與重建，療效顯著。