低劑量螺旋CT聯合循環腫瘤細胞檢測術對孤立性肺結節良惡性診斷的價值分析

宋亞男 齊 宇 張春敭 盛銀良 吳 凱 朱森林 劉帥帥 趙 松

即使在科學醫療技術快速發展的今天，癌癥依然是人類無法攻克的難題之一。而在眾多癌癥中，肺癌( lung cancer)在近50年來已悄然成為對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，尤其是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，約占肺癌總量的80%[1]。因其發病隱匿，致病原因繁多的特點，使其發病率和病死率快速增長，數據顯示，目前男性肺癌的發病率和病死率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性肺癌的發病率和病死率占第二位[2]。目前雖然對直徑較大的實體肺部腫物(直徑>3 cm)的診療手段日趨完善，但對于直徑較小(直徑<2 cm)特別是對于直徑<1 cm的孤立性肺結節(single pulmonary nodule, SPN)良惡性的診斷標準依然待定，由于未將肺癌控制在萌生階段，以至于臨床上大部分確診的肺癌患者發現時已基本處于中晚期。所以及時準確診斷是防治早期肺癌的關鍵，隨著低劑量螺旋CT(low-dose spiral computed tomography, LDCT)運用于肺癌的初步篩查，使得較小的肺部結節(直徑<2 cm)也逐漸明了[3]，但由于影像學檢查的局限性，肺部孤立性小結節良惡性的確定還需依賴后續的侵入性檢查，比如CT引導下的穿刺或是支氣管鏡取活檢，但這些侵入性檢查經常會由于結節的位置得不到理想的結果，隨著循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)檢測技術的出現和發展，這些侵入性檢測所無法觀測到的肺孤立性小結節的良惡性也將逐漸明了[4]。

肺癌的發病率及病死率在世界上所有的惡性腫瘤中都位居前列，而且其發病率正隨著工業的發展和環境污染等呈逐步上升的趨勢，由于其發病隱匿的特點，且早期診斷率非常低，僅為15%，人們往往容易忽視早期肺癌的微小體征，以至于當人們明顯感知有肺部體征時已到中晚期，對比早期肺癌切除后5年生存率為70%以上，中晚期肺癌切除后的5年生存率卻僅為20%，這就凸顯出了早期診斷是提高肺癌患者整體生存率的關鍵所在[5]。而肺部小結節(直徑<3 cm)特別是孤立性小結節(直徑<2 cm)的定性又是整個問題關鍵。隨著高分辨率LDCT運用于肺癌篩查，研究表明，直徑>1 cm的肺部結節惡變率高達50%～60%，這是纖維支氣管鏡和穿刺活檢所不能預知的[6]。然而影像學本身的假陽性率又限制了低劑量螺旋CT對于肺部小結節的診斷信任度，而對性質尚未確定的肺部小結節貿然切除又存在過度醫療的紛爭，所以對于直徑小于2cm的肺部結節往往采取隨訪的方法，這個看似保險的辦法卻也最容易延誤病情，錯過最佳時機。隨著大量研究證實了早期腫瘤的外周循環中可以檢測出腫瘤細胞，人們對肺部小結節的早期定性又有了新的希望，通過對大量相關文獻的閱讀分析，筆者認為通過低劑量螺旋CT初步篩查與循環腫瘤細胞檢測(CTC)技術相結合將有效提高惡性結節的檢出率。本文就低劑量螺旋CT聯合循環腫瘤細胞檢測術對孤立性肺結節的診斷價值及展望做進一步闡述。

一、LDCT的出現及發展狀況

LDCT用于早期肺癌篩查于20世紀90年代開始逐漸被推廣，起初由Naildich等[7]提出低劑量螺旋CT應用于肺癌篩查，由于肺組織對X射線吸收率較低且具有高對比度，在理論上是完全可行的.所以從20世紀90年代末開始，多個國家開始了運用LDCT對肺癌早期診斷的研究。日本、丹麥等國家研究表明LDCT較胸部X片具有更高的敏感性和特異性，且能清晰的發現胸部X線片所不能觀察到的微小結節，且輻射劑量低，但并沒有數據證明LDCT篩查對肺癌的生存率存在影響，而2011年8月美國國家癌癥研究所發布研究表明對高危人群行LDCT篩查，可以降低肺癌病死率[8]。

LDCT技術進行肺癌篩查主要原理是應用放射劑量與電流的線性關系，并可有效減低放射劑量，圖像具有分辨率高、無重疊等優勢。為了最大限度地降低輻射劑量，一般多采用降低管電壓、增大螺距、降低管電流等方法。降低管電壓雖然可以減少輻射劑量，但X射線穿透力也會隨之降低，圖像質量會下降。管電流技術目前主要包括管電流自動調節技術、個體化管電流掃描、固定閩值管電流掃描等。目前較新的管電流自動調節技術，能夠根據體型和受檢部位，對管電流強度值進行調節，在一定程度上補償圖像噪聲[9]。

二、LDCT從影像學特征對肺小結節良惡性的診斷價值

影像形態特征包括病灶的內部結構,也包括病灶的外圍結構，病灶的內部如分葉征、毛刺征、空泡征等，病灶的外圍結構如支氣管充氣征、胸膜凹陷征 、血管集束征、以及肺和腫瘤的邊界特癥等[10]，這些形態特征目前仍然是影像科醫師對肺結節作出定性診斷的主要依據，回顧不同團隊的分析研究，對病理結果明確的GGN的各種征象進行了歸納分析，研究表明侵襲性組和非侵襲性組之間毛刺征和支氣管擴張癥具有明顯統計學差異侵襲性組中出現毛刺癥和充氣癥的概率明顯高于非侵襲 性組，而其他征象兩組并沒有明顯的統計學差異。另一項研究報道正常肺組織與腫瘤界面、分葉癥及支氣管充氣征在侵襲性組與非侵襲性組間差異有統計學意義(P=0.02，P=0.00，P=0.048)[11]。雖 然受各種條件的制約使各項研究結果不盡相同，但這些征象的存在為肺結節的定性診斷提供一定依據，然而在臨床中很多肺小結節的影像形態學特征并不明顯，單純依靠形態學特征進行診斷具有難 度 。

Eguchi[12-13]報道了兩項結果相似的研究，用不同方法對AIS、MIA、I-ADC 平均CT值進行分組研究，組間差異均具有統計學意義。同年在Lim對直徑 ≥10 mm且持續存在的pGGN 的一項研究中，AIS 與 MIA兩組的平均CT值并沒有顯著統計學差異，但I-ADC 組的平均CT值明顯較其他兩組高[14]。這與之前相關研究報道結果均相似。各項相關研究均表明CT值對肺小結節良惡性的診斷確有價值。但有個無法回避的因素始終摻雜在其中，那就是在臨床工作中，測量的CT值中往往會包含肺紋理成分，由于個體差異所導致的人體組成并不一致，進而導致測量差異持續存在。

三、LDCT的優點及尚待解決的問題

LDCT 作為肺癌篩查的新方法，對早期肺癌的敏感度明顯高于胸部X線片。研究表明，LDCT 檢查對早期小肺癌(直徑≤20 mm)的檢出率約是胸部X線片的10倍，對Ⅰ期肺癌的檢出率明顯高于胸部X線片，并且檢出的肺癌患者的5年生存率有明顯提高[15]。在參加篩查的人群中，基線LDCT的肺癌篩出率為0.4%～3.7%，年度復查LDCT的肺癌檢出率為0.2%～2.2%。美國國家肺癌篩查試驗結果表明，與X線片對肺癌的篩查相比，LDSCT可使重度吸煙肺癌患者的病死率降低20%，這是首次發現 LDSCT 篩查能夠降低肺癌病死率[16]。

LDCT掃描方案是通過優化掃描參數，改變管電流.管電壓和螺距等來降低輻射劑量。1次常規CT胸部掃描的輻射劑量約為2～27 mSv，為X線片的10～100倍，而LDCT胸部掃描劑量0.61～1.50 mSv，美國醫學物理師協會認為如果影響學檢查的單次劑量在50 mSv以下，短期內多次累積在100 mSv以下時被認為是安全的[17]，大大降低了受檢者的受輻射劑量，這個輻射量是完全符合國際放射委員會對輻射防護正當化及最優化的要求。且有研究表明這種輻射劑量對人體的傷害所帶來的利益遠大于其本身所帶來的傷害。

LDCT的優勢在于不僅能夠清晰的看顯示出肺部結節的二維形態，還能特異性的表現出結節周圍組織的影像學特點，比如結節周圍微小的血管及走向，都為判斷其良惡性及日后手術提供參考。

假陽性率過高是LDCT肺癌篩查中最為突出的問題。臨床經驗一般認為肺部結節越小，肺癌的可能性就越小。研究報道，小于5 mm的肺部結節中，惡性比例約為3%，而大于10 mm的結節中惡性的比例高達50%左右[18]。NLST中也提到:所有直徑>4 mm且沒有特定良性鈣化的可認定為陽性結節[19]，而在后續3年所初篩的陽性結果中，假陽性結節分別為96.2%，97.6%，94.8%，過高的假陽性率往往會導致醫療資源的浪費，不僅會產生額外的經濟和心理負擔，更嚴重影響患者的生存質量。相關研究認為假陽性率增高會增加患者的焦慮情緒，不利于病情穩定，其生活質量嚴重下降，也讓患者對于其準確性產生了質疑[20]。

另外雖有多項相關研究支持LDCT篩查能降低肺癌患者病死率，但其在對肺部小結節定性的準確度上依然存在爭議，因為LDCT難以準確測量小結節的生長速度。日本一項肺癌篩查研究估計了LDCT組篩查靈敏度為88.9%，特異度為92.6%，而用發生率方法計算LDCT組篩查靈敏度為79.5%，這表明過度診斷在LDCT篩查中起到了一定作用。Marcus等[21-22]指出如果LDCT篩查有更高的靈敏度，那么LDCT篩查所導致的過度診斷率應該更高。MA根據NLST的數據補充建模分析，對LDCT篩查人群和未篩查人群進行了比較，預估計經歷7年隨訪將有31%的NSCLC患者為過度診斷，其過度診斷的癌癥比率為1.38。美國國立衛生研究院一統計學模型預測:經LDCT篩查的高危人群中。每100 000人中將有497例患者被過度診斷。此外仍有多項相關研究證實過度診斷在LDCT肺癌篩查中是常見現象[23]。

在對肺部結節的復查時間上一直存爭議，NCCN指南提出了針對結節大小所制定的復查方案：(1)對于實性和部分實性結節，①直徑<6 mm，年度LDCT篩查至少2年；②6～8 mm，3個月內復查LDCT，結節無增大，建議6個月復查，仍無增大，1年后復查；③直徑>8 mm，建議3個月后復查LDCT；④支氣管腔內實性結節，建議一個月后復查LDCT，如未消散，則建議支氣管鏡檢查。(2)非實性結節：①≤5 mm，年度LDCT篩查至少2年，如果持續增大或實性成分增加，建議3～6個月復查LDCT或考慮外科手術；②>5～10 mm，6個月內復查LDCT，結節無增大，進入年度LDCT，結節增大，建議外科手術；③>10 mm，3～6個月內復查LDCT，結節無增大，建議6～12個月內復查LDCT。活檢或外科手術；結節增大，或變為實性或部分實性結節，建議外科手術[24]。

四、循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)檢測術的興起及原理

有關CTCs的定義眾說紛紜，它是從腫瘤原發灶或轉移灶自發或擠壓脫落后進入血液循環的腫瘤細胞，它也可以通過主動脫落或被動的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition)過程進入血液循環,盡管對于CTCs遷移入血是發生在腫瘤早期還是晚期尚存疑問，但相關研究表明，當腫瘤直徑超過2 mm時便可在腫瘤內形成血管，提供營養，當然這也為腫瘤細胞脫落而進入血液循環提供了可能，Husemann[25]的相關研究更是證明了小于1 mm的腫瘤已經能在循環中檢出表達CK及HER2的腫瘤細胞！

1869年Ashworth首次在1例肺癌轉移患者外周循環血液中發現了CTCs，這次革命性的發現為后續CTCs檢查服務于臨床提供了可能[26]。而熒光標記和細胞分離技術的進步，尤其是上皮來源性的CTC檢測技術奠定了CTC運用于臨床的基礎。經過近一個世紀的發展，cellsearch系統(Veridex，Raritan，NJ)應運而生，作為CTCs檢測標準評估系統的先驅者，已獲得了美國食品藥品管理局的批準用于晚期乳腺癌，前列腺癌及結腸癌的檢測，這為將來CTCs檢測更加廣泛的運用創造了可能[27]。

CTCs的檢測方法有很多，基本包括分離富集和檢測鑒定兩個步驟。分離富集通常采用基于CTCs密度和大小的形態特征或分子特征，包括密度梯度離心法，免疫磁性分選法，膜濾過上皮腫瘤體積分離法等；檢測鑒定技術根據原理可分為細胞計數法和核酸檢測法，如免疫細胞化學技術，流式細胞計數法，RT-PCR檢測技術和最具發展潛力的CTCs芯片等[28]。而最為常用的則是基于免疫磁性并同時檢測CTCs的CellSearch系統，這也是目前唯一被美國FDA批準進入臨床用于CTCs檢測及預后評估手段的技術。Cellsearch系統是一個半自動化的檢測系統，每次檢測僅需7.5 ml的外周血樣品，在檢測過程中通過包被上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體的磁性顆粒對腫瘤細胞進行富集，因腫瘤細胞屬于上皮源性，上皮細胞黏附分子并不表達于血液細胞，所以表達EpCAM的腫瘤細胞可以與抗體特異性結合，通過與血液細胞分離而達到富集的目的。磁珠富集CTCs后，固定細胞并用DAPI熒光核染料標記細胞核，經過細胞內角蛋白熒光抗體CK-PE識別，白細胞熒光抗體CD45檢測并排除白細胞，最終符合腫瘤細胞形態特征并表達EpCAM.DAPI.CK-PE和CD45的循環腫瘤細胞就被篩選出來[29]。

五、CTCs檢測術的應用現狀及發展

研究證明，CTCs廣泛存在于乳腺癌、結直腸癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中[30-31]。在肺癌方面，目前CTCs檢測術主要運用于NSCLC術后的復發轉移檢測、療效檢測及耐藥識別，判斷患者預后和化療療效評估，但很少運用于肺部小結節的早期診斷。非小細胞肺癌的預后是多因素決定的，目前主要是根據腫瘤的組織類型，TNM分期，臨床特征等對患者預后進行判斷，但對于估測組織類型和TNM分期均未知的小結節而言，CTCs有著獨特優勢[32]。多項研究使用Cellsearch系統檢測了101例中晚期的非小細胞肺癌患者化療前后外周血中CTC計數變化，結果提示化療前CTCs值>5的患者與CTCs值<5的患者相比，其PFS以及OS明顯縮短[33]。這說明了CTC值的變化與患者臨床預后明顯相關。也有研究證實，通過檢測CTCs上的生物標志物也能達到判斷預后的目的。另一項研究納入78例晚期非小細胞肺癌患者，使用RT-PCR技術分析其化療前，化療1和3周期后血液中CTC的凋亡抑制基因Survivin，對比發現，化療后血液中Survivin陽性CTC的患者PFS以及OS明顯短于陰性患者可。

CTC的提取和富集仍是研究者遇到的首要問題，相關研究表明，CTCs在血液中的含量很少，在患者外周血中提取困難，1 ml外周血中才存在一個CTCs細胞，極大增加了檢測的難度，并且部分CTC在發生EMT過程中常發生細胞形態改變，出現間充質細胞屬性，而這種改變對CTCs檢測技術的敏感性與特異性提出更高要求[34]。

肺非小細胞肺癌患者中的CTC檢測的敏感性和特異性仍然存在困難，Cellsearch系統作為CTCs檢測標準評估系統的先驅，一項使用 Cell Search 系統檢測對比CTC s檢出率(樣本分別為7.5 ml和 30 ml外周血)的研究發現，CTC檢出率分別為67%和87%。基于此研究，Possion 分布統計可以得出 7.5 ml外周血擁有500個 CTC，捕捉﹥1個CTC的幾率為50%。Cellsearch其主要是依靠識別上皮細胞標志物來識別CTCs,但是在肺EMT過程用容易丟失這些標記物從而導致該經典方法無效，也同樣使通過EpCAM微流體CTCs芯片檢測CTCs變得困難[35]；有研究表明，根據上皮腫瘤細胞大小分離法檢測CTC的陽性率高于Cellsearch系統，但是其捕獲的細胞假陽性率也居高不下，因此具有高敏感度和特異度的捕捉技術仍是臨床檢測的關鍵[36]。

六、LDCT聯合CTCs檢測術的必要性和緊迫性

當前肺癌在我國發病率和病死率居高不下，因此對高危地區、高危人群進行LDCT篩查變得十分迫切，可以明確，目前LDCT雖然作為早期肺癌的初篩首選，被越來越多的人群接受，但新的問題是我們依然對但對于直徑<10 mm特別是直徑<5 mm的肺部孤立性結節良惡性診斷的束手無策，同時也讓研究者深感遺憾。隨著CTCs檢測術的不斷成熟與發展，人們又看到了新的曙光，相關研究早已證實當腫瘤直徑超過2 mm時便可在腫瘤內形成血管，提供營養，當然這也為腫瘤細胞脫落而進入血液循環提供了可能[37]。另一項研究更是證明了小于1 mm的腫瘤已經能在循環血液中檢出表達CK及HER2的腫瘤細胞，那么直徑<5 mm的肺部孤立性肺結節就也有產生CTCs的可能，Mitra等[38]研究結果表示以循環腫瘤細胞計數大于25為臨界值，循環腫瘤細胞篩查特異度為100%，敏感度為89%，這就彌補了影像學在小于5 mm肺部腫物的性質診斷的空白。

另外病理組織活檢作為診斷腫瘤良惡性的金標準，其侵入性給人體帶來了很大傷害，因此很多患者不愿做此類檢查而選擇繼續觀察，從而延誤病情[39]。病理活檢過程中由于機械穿刺破壞腫物完整性，還可能導至人為性的腫物細胞脫落，這也是一個巨大的威脅，由于CTCs檢測術的標本為血液，這就很大程度的避免了這種威脅。因此，通過LDCT的初步篩查出GGN，再通過CTCs檢測術捕捉相關腫瘤細胞，根據其表面生物標志物對腫瘤細胞進行定性，就可以及時做出相應的治療措施，從而提高早期肺癌患者的整體生存率，降低病死率。

腫瘤轉移及復發的過程均是一個循環腫瘤細胞定植生長的級連放大的瀑布反應[40]。目前腫瘤的發現和診斷仍高度依賴于影像學及腫瘤特異性血清標志物的方法，不能及時發現腫瘤的轉移和復發。基于腫瘤細胞播散理論，CTCs檢測可能更早發現腫瘤的早期轉移，與目前經典的標志物和影像學相比，CTCs檢測具有非侵入性、高敏感性、便捷性等優勢，其在預后評估、檢測復發方面的價值也逐漸凸顯出來。

七、展望

LDCT因其放射劑量低、對人體危害程度小、圖像具有分辨率高、無重疊等優勢逐漸成為肺部腫瘤早期篩查的首選[41]，但是對于肺小結節特別是直徑<5 mm的小結節的診斷仍然不明，結節太小而又無法準確進行病理活檢，所以按目前對于小于5 mm的肺部結節建議隨訪的標準，我們很有可能錯過了惡性肺小結節，所以隨訪很有可能延誤病情，因此CTCs檢測術就很有必要作為LDCT初篩后的補充，對直徑<5 mm的肺小結節進一步精確診斷，從而提高肺癌早期診出的陽性率，降低整體病死率，盡管CTCs檢測技術面對很多問題，但研究者們正在做出努力來提高陽性率，如開發新一代CTC芯片，利用多肽納米磁珠來捕獲外周血中的CTCs、采用肺靜脈血代替外周血作為樣本來提高檢出率等，都將預示著CTCs檢測術的未來[42-43]。相信在不久的將來，LDCT聯合CTCs檢測會逐漸取代CT初篩后的病理組織活檢等侵入性檢查，對于直徑小于5 mm肺部結節做出更為準確的判斷，進而開啟肺癌早期篩查與治療的新篇章。