BRAF V600E基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌治療中的研究進(jìn)展

張祥濤 劉睿清 張憲祥 盧云

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。其中，V-raf鼠肉瘤毒癌基因同源體B（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog，BRAF）V600E突變的結(jié)直腸癌是一種獨(dú)特的結(jié)直腸癌分子亞型，具有特殊的分子和臨床病理特征，惡性程度高且缺乏有效的治療手段，患者預(yù)后極差。BRAF V600E基因突變還常見于惡性黑色素瘤、甲狀腺乳頭狀癌等。既往研究聚焦于通過(guò)阻斷關(guān)鍵激酶BRAF和MEK活性抑制信號(hào)通路，盡管針對(duì)這些靶點(diǎn)的靶向藥物在黑色素瘤臨床治療中取得了顯著療效，但也面臨單藥治療快速耐藥的問(wèn)題，其結(jié)果是腫瘤細(xì)胞通過(guò)各種機(jī)制重新激活MAPK信號(hào)通路[1-3]。而BRAF V600E結(jié)直腸癌患者中BRAF V600E和MEK靶向藥物單藥和聯(lián)合使用療效遠(yuǎn)不及黑色素瘤[4-5]。本文將重點(diǎn)討論BRAF V600E基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌診治中的最新進(jìn)展。

一、BRAF基因突變與結(jié)直腸癌演進(jìn)

1.結(jié)直腸癌分子遺傳學(xué)改變與BRAF基因突變

結(jié)直腸癌是通過(guò)多種遺傳和表觀遺傳途徑發(fā)展的，主要有三條途徑：染色體不穩(wěn)定（chromosomal instability，CIN）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）以及CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）等途徑[6-8]。這些途徑均具有特定的病理特征、致癌機(jī)制和腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。這些通路的分子方面已被臨床用于結(jié)直腸癌的診斷、篩選和管理。

Lengauer等[9]在非整倍體腫瘤細(xì)胞中首次證實(shí)CIN的存在。CIN指的是DNA片段受到缺失或擴(kuò)增事件影響的拷貝數(shù)畸變（CNA）的獲得率[10]。它存在于絕大多數(shù)結(jié)直腸癌中（約70%）[11]，可導(dǎo)致APC、TP53等抑癌基因和KRAS等癌基因發(fā)生一些有害突變[12-13]，所以它和結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[14]及存活率[15]等密切相關(guān)。CIN在BRAF野生型的傳統(tǒng)腺瘤中發(fā)生，并通過(guò)“傳統(tǒng)途徑”向惡性進(jìn)展。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite stability，MSI）是由于DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch-repair，MMR）基因的種系/體細(xì)胞突變導(dǎo)致的DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷。MSI腫瘤的發(fā)生受錯(cuò)配修復(fù)基因失活的驅(qū)動(dòng)，錯(cuò)配修復(fù)基因通過(guò)修復(fù)DNA復(fù)制錯(cuò)誤、抑制非相同DNA序列的重組以及干擾對(duì)DNA損傷的反應(yīng)，在揭示遺傳穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DNA-MMR系統(tǒng)包括四種眾所周知的蛋白質(zhì)：MLH1、MSH2、PMS2和MSH6，它們作為異質(zhì)二聚體相互作用[16]。

在結(jié)直腸癌中，MSI檢測(cè)分為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（MSI-H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定性（MSI-L）和微衛(wèi)星穩(wěn)定性（MSS）。MSI約占所有結(jié)直腸癌腫瘤的8%～20%，Ⅱ期（20%）比Ⅲ期（12%）和Ⅳ期（4%）更常見[11，17]。近年來(lái)，很多學(xué)者研究表明BRAF基因突變與MSI影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。Sinicrope等[18]研究發(fā)現(xiàn)MSI結(jié)直腸癌比MSS-結(jié)直腸癌具有更好的預(yù)后和更少的轉(zhuǎn)移。其他研究也表明，與MSS/MSI-L結(jié)直腸癌患者相比，Ⅱ期病理腫瘤的MSI-H結(jié)直腸癌患者預(yù)后更好，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更低[19]。BRAF突變型/MSI癌癥預(yù)后良好，其次是BRAF野生型/MSS癌癥，而BRAF突變型/MSS癌癥的預(yù)后非常差[20-21]，但分子機(jī)制仍不清楚。Bond等[22]研究發(fā)現(xiàn)在BRAF突變型/MSS癌癥中存在明顯的高水平CIN，且這種類型越接近晚期，總CIN水平升高越顯著。不同的是BRAF野生型/MSS癌在早期和晚期的CIN發(fā)生率相當(dāng)。該研究還發(fā)現(xiàn)BRAF突變型/MSS癌與BRAF野生型/MSS癌的p53突變率相當(dāng)，明顯高于BRAF突變型/MSI癌的p53突變率。這可能是該類型癌癥預(yù)后差的原因。Koinuma等[23]研究證實(shí)BRAF突變癌主要發(fā)生在近端結(jié)腸。Bond等[22]同樣證實(shí)大部分BRAF突變型/MSS的癌癥來(lái)自該區(qū)域（約69%），但近端癌與遠(yuǎn)端癌的CIN發(fā)生率無(wú)差異。Sérgia等[24]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中MSI組BRAF突變率明顯高于MSS組（分別為28%和7.5%）。研究還顯示MSI結(jié)直腸癌比MSS結(jié)直腸癌更容易發(fā)生BRAF V600E基因突變[25-26]。

Toyota等[27]解釋了CpG島甲基化表型（CIMP）是另一種致瘤途徑。CpG島是指CpG二核苷酸聚集區(qū)域。在活化基因的5′非編碼區(qū)啟動(dòng)子內(nèi)，CpG島都是去甲基化狀態(tài)[28]。啟動(dòng)子區(qū)CpG島（亦稱5′CpG島）甲基化將直接或間接地抑制轉(zhuǎn)錄，所以它可以抑制下游基因表達(dá)。結(jié)腸直腸癌中的CIMP可能通過(guò)一種獨(dú)特的途徑發(fā)生，這種途徑起源于某些亞型的鋸齒狀息肉[29]，在所有結(jié)腸直腸癌病例中約有15%的CIMP存在[30-31]。Weisenberger等[32]發(fā)現(xiàn)CIMP陽(yáng)性（CIMP＋）腫瘤包含大部分情況下的腫瘤BRAF突變。偶見的錯(cuò)配修復(fù)缺陷幾乎完全是由于CIPM相關(guān)的MLH1甲基化所致。依據(jù)CIPM在BRAF基因突變鋸齒狀腺瘤中的表達(dá)，將腺瘤分為的3個(gè)組：高CpG島甲基化表型（CIMP-1）、低CpG島甲基化表型（CIMP-2）和非CIMP分組，3個(gè)組在結(jié)直腸癌中的突變率分別為77%、18%和0（P＜0.0001）[33]。說(shuō)明BRAF基因突變和CpG島甲基化有關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)BARF V600E基因發(fā)生突變，可以使細(xì)胞對(duì)凋亡刺激產(chǎn)生抵抗，使得MLH1基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化，而使細(xì)胞發(fā)生MSI[34-35]。Bond等[22]在BRAF突變體/MSS癌癥中，CIN和CIMP同時(shí)出現(xiàn)的頻率很高（72%）。

2.BRAF基因突變及MAPK信號(hào)通路

RAS/MAPK通路與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT通路共同構(gòu)成了參與癌癥發(fā)生的基因轉(zhuǎn)錄的連續(xù)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)后最著名的信號(hào)傳遞通路之一。MAPK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)將有絲分裂和其他刺激信號(hào)從細(xì)胞膜上的受體（如EGFR）傳遞到細(xì)胞核。細(xì)胞表面受體下游的Ras小胍三磷酸酶（GTPase）激活絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白R(shí)AF家族，導(dǎo)致MAPK和ERK激酶（MEK）蛋白磷酸化和活化，隨后磷酸化并激活ERK蛋白。ERK蛋白激活后磷酸化多種底物，包括多種轉(zhuǎn)錄因子，并調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、血管生成和抑制凋亡等幾個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞活動(dòng)[36]。RAF家族還包括ARAF和CRAF，但BRAF具有最強(qiáng)的基礎(chǔ)激酶活性，是MEK/ERK蛋白最有效的激活劑。

MAPK/ERK信號(hào)通路的異常激活參與了許多人類惡性腫瘤[37]。在實(shí)體腫瘤中，BRAF突變的發(fā)生率最高，V600E替代約占突變的80%，與野生型蛋白相比，BRAF中的所有突變都具有更高的激酶活性，從而刺激MAPK/ERK活性。

3.BRAF基因突變與KRAS基因突變的相關(guān)性研究

RAS基因家族包括HRAS、KRAS、NRAS，人類表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）級(jí)聯(lián)反應(yīng)與KRAS基因突變相關(guān)[38]。BRAF基因是KRAS基因的下游作用因子，同屬RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路[39]。CIMP-1類結(jié)直腸癌主要與BRAF基因突變相關(guān)（通常為BRAF V600E）。CIMP-2類結(jié)直腸癌主要與KRAS基因突變相關(guān)[40]。KRAS和BRAF基因突變互相排斥的關(guān)系在肺癌中也有類似的報(bào)道[41]。

宋敏等[42]研究表明KRAS基因突變與結(jié)直腸癌患者的年齡、發(fā)病部位及肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，BRAF基因突變與性別、分化程度、腫瘤TNM分期有關(guān)。與腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)等臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。

二、BRAF V600E突變結(jié)直腸癌的治療

1.有關(guān)針對(duì)BRAF基因及下游作用因子的靶向治療

近年來(lái)，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，靶向治療已經(jīng)成為治療結(jié)直腸癌的有效手段。目前EGFR基因是臨床上治療結(jié)直腸癌的主要靶點(diǎn)之一，但由于BRAF基因突變，導(dǎo)致出現(xiàn)抗EGFR藥物抵抗。EGFR靶向抑制劑帕尼單抗和西妥昔單抗對(duì)于BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌患者治療效果差，且預(yù)后不良，中位生存期僅為6～9個(gè)月[43]。而BRAF V600E突變型黑色素瘤患者對(duì)靶向抑制BRAF或聯(lián)合其下游效應(yīng)器MEK抑制劑治療效果明顯，可獲得高達(dá)80%的有效率[44-45]。BRAF突變型的黑色素瘤對(duì)BRAF抑制劑維羅非尼的有效率為60%[46]。而轉(zhuǎn)移性BRAF突變型結(jié)直腸癌患者的臨床研究顯示，維羅非尼單藥治療時(shí)無(wú)臨床獲益[47]。研究發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌相比，黑色素瘤細(xì)胞不是上皮細(xì)胞，通常不表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子。BRAF V600E結(jié)直腸癌對(duì)單藥BRAF抑制缺乏應(yīng)答，被推測(cè)至少部分原因是EGFR的反饋激活導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路重新激活。

BRAF突變結(jié)直腸癌的應(yīng)答需要強(qiáng)有力的MAPK通路抑制，Corcoran等[48]研究發(fā)現(xiàn)，雙重MAPK通路阻斷BRAF抑制劑達(dá)拉法尼和MEK抑制劑曲米替尼可以導(dǎo)致BRAF突變結(jié)直腸癌患者的臨床獲益。盡管其他信號(hào)通路可能在本病中發(fā)揮重要作用，但這些數(shù)據(jù)表明，有效抑制MAPK信號(hào)通路在BRAF突變的結(jié)直腸癌中是至關(guān)重要的，需要能夠?qū)崿F(xiàn)更好的MAPK抑制的治療策略。Kopetz等[49]研究表明：BRAF V600E抑制劑聯(lián)合伊立替康及西妥昔單抗治療相較單純使用伊立替康聯(lián)合西妥昔單抗治療的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間有顯著的延長(zhǎng)，由2個(gè)月提高至4.4個(gè)月。Kopetz等[50]研究發(fā)現(xiàn)將三聯(lián)體方案與雙聯(lián)體方案進(jìn)行比較的總體存活率分析，顯示三聯(lián)體方案的死亡率風(fēng)險(xiǎn)比為0.79。不良事件發(fā)生率三聯(lián)療法組與雙聯(lián)療法組相似，3級(jí)及以上毒副作用發(fā)生頻率對(duì)照組略高于兩組。作為三聯(lián)療法的一部分，比尼梅替尼的加入增加了一些與MEK抑制相關(guān)的附加毒性作用。三組和雙組的停藥率和相對(duì)劑量強(qiáng)度相似。雖然三聯(lián)治療具有BRAF V600E突變的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，其總體生存期明顯長(zhǎng)于標(biāo)準(zhǔn)治療。但BRAF V600E突變的結(jié)直腸癌的治療還需進(jìn)一步研究。

2.BRAF突變晚期結(jié)直腸癌的免疫治療

目前的研究結(jié)果表明，MSI狀態(tài)下的結(jié)直腸癌預(yù)后較好。Le等[51]的研究表明MSI狀態(tài)可以指導(dǎo)患者進(jìn)行免疫治療，即PD-1抑制劑可以明顯改善MSI-H狀態(tài)患者的預(yù)后。程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）抑制劑納武單抗（nivolumab）現(xiàn)已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于各類表現(xiàn)為MSI-H的惡性腫瘤。BRAF-mt結(jié)直腸癌患者中約20%患者同時(shí)存在MSI-H表型，這部分患者或許能從抗PD-1/PDL1治療中受益。

三、總結(jié)與展望

BRAF V600E突變是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展扮演重要的角色，雖然目前聯(lián)合治療對(duì)結(jié)直腸癌BRAF V600E突變有一定效果，但仍會(huì)出現(xiàn)耐藥情況，基于BRAF V600E突變?cè)诮Y(jié)直腸癌靶向治療的重要性，我們?nèi)孕枭钊胙芯緽RAF基因及MAPK通路，改進(jìn)腫瘤靶向治療方案，降低結(jié)直腸癌的死亡率。