缺氧誘導因子通路在骨發育中的作用及研究進展*

郭慶圓 劉洪臣

骨組織含血量約占心排血量的5%～20%，但骨髓是一個缺氧的微環境，骨髓中含有調節細胞增殖分化和信號轉導等多種因子，這些因子調節著骨骼各種復雜的病理、生理活動。腫瘤的切除、外傷、感染或其他原因導致的骨缺損，損傷后血流中斷或減少而導致局部缺氧。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)是機體組織、細胞適應低氧或缺氧環境的主要調節因子，包括HIF-1α 和HIF-2α。常氧條件下，HIF-1α 和HIF-2α 被脯氨酰羥化酶(PHD)羥基化，使HIF-1α 與腫瘤抑制蛋白(pVHL)結合，從而導致pVHL 的泛素化和HIF 蛋白的降解[1]。在缺氧條件，PHD 活性下降，HIF 蛋白α 亞基的積累，轉運到細胞核中，并與HIF 靶基因上的缺氧反應元件(HRES)結合[2]。缺氧反應基因的轉錄活化影響許多細胞過程，包括血管生成和糖酵解，從而調節骨骼的發育、修復及促進腫瘤細胞的進展。研究表明HIF 可調節多種靶基因如血管內皮生長因子(VEGF)、促紅細胞生成素(EPO)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、轉鐵蛋白、糖酵解酶和轉化生長因子-β(TGF-β)的表達[3]，這些靶基因的產物參與細胞凋亡、能量代謝、紅細胞生成和血管生成等多種病理生理過程，在細胞和機體的生理反應中至關重要。因此，在機體適應缺氧環境的過程中，HIF-1 起著關鍵的作用。對于骨骼系統，HIF 對骨和軟骨的形成也是十分重要的。骨骼系統中存在多種缺氧反應，HIF 在其中發揮著重要的作用[4]。

1.HIF的結構及生物學特點

HIF 對維護細胞的氧平衡是必不可少的。HIF有三種亞型：HIF-1、HIF-2 和HIF-3。每種亞型都是由α 和β 亞基構成的異二聚體，Semenza等[5]發現了HIF-1 蛋白能特異性地結合于促紅細胞生成素基因的缺氧反應元件上，HIF 的α 亞單位包含兩個轉錄激活域：N 端(N-TAD)和C 端(C-TAD)。N-TAD 與氧依賴性降解(ODD)域重疊，從而導致α 亞基結合到VHL 抑癌蛋白上泛素化隨后被降解[6]。PHD 是一種氧傳感器，它的活性至關重要，并且受氧張力調節。在缺氧條件下PHD 是不活躍的甚至無效的，導致α 亞基積累并被輸入細胞核。β 亞基是穩定的，可以檢測細胞質和細胞核處于常氧還是缺氧條件下。HIF 的α-β二聚體結合到HIF 靶基因的增強子-啟動子區內的HRE 上，從而啟動負責缺氧適應的靶基因轉錄。至今已發現四種PHD 和10 多個由HIF 調節的靶基因。這些HIF 調節的基因參與細胞生物行為的多個方面，包括促紅細胞生成素，葡萄糖轉運蛋白和VEGF。在不同組織有不同的HIF 亞型的表達并且不同的亞型發揮著不同的作用[7]。

HIF 不僅被缺氧調節，也被一些金屬離子(如Mg2+、Ni2+、Cu2+等)、物理因素如超聲波和一些細胞因子，包括白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等調節[8]。一個復雜的系統控制著HIF 調節體系，其中涉及多個調控機制，包括轉錄、翻譯、核運輸及由下游基因形成的反饋回路。不同的信號轉導通路也可以通過磷酸化的α-亞基調節HIF，包括(PI3K)/AKT，p38，細胞外信號調節激酶(ERK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[9]。

2.HIF介導骨發育

骨發育主要有兩種不同的形成機制，骨膜成骨或軟骨內成骨。除了顱面骨發育是由間充質細胞直接分化為成骨細胞(骨膜內成骨)以外，其他的骨骼均來自軟骨原基礦化成骨，這一過程被稱為軟骨內成骨。軟骨內成骨過程中，間充質細胞凝聚分化為軟骨細胞，形成胚胎生長板。生長板軟骨細胞具有很強的增殖能力，在分裂時，它們也會堆積形成柱狀層。柱狀層的最遠端細胞停止增殖，退出細胞周期，分化為肥大軟骨細胞，礦化其周圍基質。隨后，血管侵入軟骨膜在骨化中心礦化成骨[10]。

缺氧信號通路是骨發育的關鍵。胚胎生長板是一種獨特的間充質組織(因為它是缺血性的)，由于其無血管性，胚胎生長板具有內缺氧區。遺傳實驗表明，HIF-1α 是體內這些缺氧的軟骨細胞存活的關鍵因子，HIF-1α 缺乏將導致胚胎生長板缺氧區內大量細胞死亡。此外，間充質凝聚的肢芽也是缺氧的，肢芽內HIF-1α 缺乏將阻滯間充質細胞分化為軟骨細胞[11]。

VEGF 是HIF-1α 和HIF-2α 作用的目標，它不僅在調節血管生成和軟骨骨化的肥大軟骨細胞中表達，也在胚胎生長板內缺氧區內表達。選擇性敲除小鼠VEGF 基因導致生長板細胞死亡，相似的現象也出現在HIF-1α 缺失的發育軟骨中。此外，在增殖的軟骨細胞中VEGF 的表達需要軟骨有足夠的氧氣供應，這由軟骨膜內血管生成來實現。因此，HIF-1α 在缺氧性軟骨細胞中的促生長功能可能完全或部分通過其下游靶點VEGF 介導。然而，Maes 等對這一假設的驗證表明，軟骨中HIF-1α基因敲除的致死作用只能通過VEGF 轉基因表達部分恢復，提示VEGF 依賴細胞存在自主機制。特別是在軟骨細胞內，VEGF 過表達可以阻止細胞凋亡，這有可能是通過增加軟骨膜血管數量實現的[11]。這些研究結果表明，VEGF 可能是HIF-1 下游的關鍵靶基因。不同于HIF-1α 的是，HIF-2α 對生長板發育的作用是可有可無的，在肢芽間充質細胞同時敲除HIF-1α 和HIF-2α 可導致生長板異常，在僅缺乏HIF-1α 的標本中也觀察到相同的現象[12]。

3.HIF對成骨細胞和骨細胞的調控

成骨細胞對氧濃度有絕對的要求，氧氣的供應可影響成骨型。HIF 的功能與骨生成密切相關，因為HIF 能激活血管生長因子如VEGF 的表達。VEGF 活化給成骨細胞增加了血液供應，增加了它們的供氧量。因此，微血管浸潤是軟骨內成骨和骨膜成骨開始的一個跡象。在實驗中，0.02%氧濃度被認為是缺氧，1%～5%是低氧和18%～21%為常氧。已經有實驗證明HIF 調節VEGF 的表達[13]，低氧已被證實是引發HIF 調節VEGF 表達的啟動因素。除了HIF 以外的其他因素，如薯蕷皂甙元，可以啟動一個與HIF 類似的過程，提高VEGF 基因的表達，甚至在常氧的條件下。許多實驗支持缺氧條件下VEGF 的表達主要與HIF-1α 有關的觀點，也有實驗表明HIF-2α 和VEGF 之間有關聯。當人骨肉瘤細胞在24h 1%氧張力的缺氧條件下，VEGF mRNA 水平升高四倍。核提取物免疫印跡顯示HIF-2α 的增加呈現時間依賴性，其先于在VEGF mRNA 的表達出現。在缺氧條件下骨細胞中HIF-1α 的表達也可上調，骨細胞內氧的供應取決于體液的壓縮力的被動擴散。急性廢用，消除了壓縮則導致骨細胞的缺氧狀態，使細胞內HIF-1α的表達上調[14]。

雖然成骨細胞和骨細胞可能在缺氧的環境中發生適應性反應，多數研究者認為缺氧影響成骨細胞和骨細胞表型的維持。對于成骨細胞，當環境氧濃度從20%降至5%，然后降至2%時，礦化結節可能減少1.7～11 倍。更令人吃驚的是，氧濃度為0.2%可能完全阻止礦化結節的形成。胸苷摻入實驗表明，礦化結節形成減少是與成骨細胞增殖率降低相關[15]。缺氧的環境也會影響成骨細胞的表型，使堿性磷酸酶活性、堿性磷酸酶的mRNA 表達水平和骨鈣素(OCN)明顯降低。另一方面，脂肪細胞表型也可以通過缺氧誘導[16]。細胞外基質中缺氧則成骨細胞產生的膠原組織不良，立即導致骨力學性能的下降[17]。

細胞活力檢測顯示成骨轉錄因子Runx-2 對膠原蛋白分泌起著潛在的促進作用。缺氧和低氧導致Runx-2 下調，從而導致Ⅰ型膠原和OCN 的表達減少。抑制骨形成蛋白-2(BMP-2)也可能有助于Runx-2 的下調，用重組BMP-2 預處理成骨細胞能恢復缺氧條件下Runx-2 的表達[18]。這種現象也發生在其他具有成骨潛能的祖細胞中，如脂肪來源的間充質干細胞(ASC)和血管周細胞。在高壓氧環境中，HIF-1α 的表達受到抑制，促進成骨，結節形成礦化，堿性磷酸酶活性增加。以牽引成骨模型作為例子，當22.4Gy 照射了一個下頜骨骨折，血管生成與對照相比減少1.7 倍，和成骨作用有顯著相關性，而高壓氧明顯逆轉這種損傷[19]。然而，其他研究表明，這一觀察結果可能與其他條件有關。例如，已經發現高壓氧在10%胎牛血清(FCS)可促進成骨細胞增殖，而2%FCS 可抑制成骨細胞增殖[20]。

4.HIF對破骨細胞的調控

破骨細胞是負責骨吸收的多核細胞，來源于循環系統中單核巨噬細胞系的造血前體干細胞，為氧感應細胞。一些腫瘤細胞(如前列腺癌細胞，乳腺癌細胞與骨巨細胞瘤細胞)可以在腫瘤部位造成嚴重的骨溶解。這個侵襲現象與HIF-1α 在腫瘤細胞中的高表達有關。缺氧是破骨細胞形成和骨吸收的主要刺激因子。當氧張力從正常水平下調至2%時，破骨細胞最多可以傳代21 代。最新研究表明，破骨細胞的大小由白血病抑制因子(LIF)/LIF 受體信號和HIF 通路控制。LIF 通過PHD 轉錄下調影響HIF-1α，進而增加HIF-1α 的表達。HIF 也被證明是調節破骨細胞的一個主要因子，并能誘導干細胞分化為破骨細胞[21]。在缺氧情況下，破骨相關的因子如肝細胞生長因子(HGF)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)可引起單核來源的破骨細胞和巨細胞瘤細胞的HIF-1α 的表達。HIF 下游基因表達的激活，如Bcl-2，BNIP3，Glut-1 和VEGF。VEGF 會刺激破骨細胞。缺氧條件下骨肉瘤細胞培養基懸浮液能明顯促進破骨細胞的分化。當利用小干擾RNA(siRNA)沉默MG-63 的HIF 基因，破骨細胞的數量明顯減少，表明進自分泌或旁分泌的VEGF 促進破骨細胞的產生，也解釋了為什么特定的腫瘤可以引起骨溶解[22]。此外，因為HIF 是骨橋蛋白(OPN)的上游基因，缺氧的骨細胞會增加其OPN 的表達，OPN 是一種強效破骨細胞趨化劑，它的表達會增加破骨細胞的轉移和吸附。研究發現，缺氧通過HIF-1α/BNIP3 調控前體破骨細胞的自噬作用，當前體破骨細胞的胞質內容物發生降解及結構調整后即形成破骨細胞[23]，此外HIF-1α對軟骨細胞的存活、增殖、分化和軟骨基質的形成也有非常重要的影響[24]。HIF-1α 可以促進間充質干細胞向成骨性細胞系分化，并且增加ALP 的活性和Ⅰ/Ⅲ型膠原的產生[25]。總之，這些研究結果表明，缺氧和HIF-1α 誘導破骨細胞功能增強。

5.結語

缺氧是人正常發育的一個重要的生理因素，并參與許多疾病的發生、發展，胚胎的發育、骨缺損的修復以及腫瘤的轉移，HIF-1α 是目前發現的缺氧狀態下發揮特異性活性的轉錄因子。HIF-1α 是通過調節缺氧基因的表達來維持細胞內穩定的氧環境，同時，它還參與調控細胞分化、血管生成、糖代謝、炎性細胞及干細胞歸巢等眾多生理病理反應，在決定細胞命運中起著重要的作用。此外，HIF 通路在腫瘤細胞適應缺氧的的過程中起著重要的作用，通過激活靶基因調節血管生成、細胞增殖、存活、葡萄糖代謝和遷移。

越來越多的證據表明，HIF 通路中在骨發育的過程中起著重要的作用。新生血管可以向骨損傷處輸送成骨細胞和前體破骨細胞，血管內皮細胞還能誘導間充質干細胞分化為成骨細胞系，血管生成因子可以通過刺激內皮細胞產生成骨性生長因子，調節骨祖細胞的募集、成骨細胞的增殖分化及破骨細胞的活性。此外，HIF 通路已被用來作為一種加速骨損傷后愈合的方法，HIF 通路功能的自分泌或旁分泌的方式直接刺激骨髓間充質干細胞和成骨細胞的分化、增殖、遷移和獨立的血管生成，從而加速骨礦化。我們需要進一步的工作闡明HIF通路與骨發育之間的關系，并為加速骨修復和再生提供新的方法。