14-3-3η 表達水平對依那西普治療的類風濕關節炎患者臨床應答的預測價值

王希佳，程佳芬

上海市第十人民醫院1 臨床藥學科；2 腎臟風濕科，上海 200072

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵蝕性關節炎為主要臨床表現的慢性自身免疫疾病；高發于30～50 歲女性，全球發病率為0.5%～1%[1]。目前在常用的抗風濕類藥物中，TNF 抑制劑由于較好的療效和安全性受到廣泛關注，其中，依那西普是中國治療RA 最常用的TNF 抑制劑[2]。盡管依那西普的單用或聯用在大多數RA 患者中效果顯著，但仍有部分患者對于依那西普缺乏應答[3]。另外，依那西普的藥物成本較高，患者的經濟負擔較大。因此，亟待探索影響依那西普治療RA 療效的因素，以期提高療效并進行個體化治療，從而減輕患者負擔。

14-3-3 蛋白是由不同基因編碼的、以穩定的同源/異源二聚體形式結合的、高度保守的酸性蛋白家族，通過控制蛋白在不同信號通路中的活性來調控各種生理和病理過程，包括自身免疫性疾病，如RA、多發性硬化癥等[4，5]。作為7 種不同的亞型的一種，14-3-3η 蛋白可以增加促炎信號傳導以及炎性介質，并與RA 患病風險密切相關；然而，其與依那西普治療RA 患者的臨床療效的關聯尚不明確[6]。因此，本研究旨在評估14-3-3η 表達水平與RA 患病風險、疾病活動度的關聯，并且探索其在依那西普治療RA 患者臨床應答中的預測作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究納入2014 年7 月至2017 年6 月在本院接受依那西普治療的88 例活動性RA 患者。

納入標準：①符合美國類風濕病協會1987 年修訂的RA 分類標準；②年齡滿18 周歲；③中重度疾病活動度，定義為基于紅細胞沉降率的28 關節疾病活動度評分 〔28-joint disease activity score based on erythrocyte sedimentation rate，DAS28（ESR）〕≥3.2；④自愿接受依那西普聯合甲氨蝶呤（MTX）或來氟米特（LEF）治療24 周；⑤經研究者評估可定期隨訪。

排除標準：①有依那西普禁忌癥者；②曾經或正患有除RA 以外的炎癥性關節炎，如痛風、反應性關節炎、銀屑病關節炎、血清陰性脊柱關節病等；③合并除RA 以外的其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、混合性結締組織病、硬皮病、結核病、多肌炎等；④伴有活動性或復發性的細菌、病毒、真菌、分支桿菌感染病史的患者；⑤伴有惡性疾病，如血液系統疾病或惡性腫瘤等；⑥孕婦或哺乳期婦女。

入組RA 患者平均年齡為57.7±11.3 歲，男性16 例（18.2%）、女性72 例（81.8%）；平均身體質量指數（BMI）為22.1±3.4 kg·m-2；中位病程為3.3 年（四分位值：1.5～6.9 年）；類風濕因子（RF）陽性者59 例（67.0%），抗環瓜氨酸肽抗體（ACCP）陽性者60 例（68.2%）；有生物制劑治療史者14 例（15.9%）；壓痛關節數（TJC）為7.3±3.4，腫脹關節數（SJC）為6.7±3.5；紅細胞沉降率（ESR）為（46.3±26.4）mm·h-1；C反應蛋白（CRP）為（45.3±37.4）mg·L-1；DAS28（ESR）評分為5.3±0.7；健康評估問卷殘疾指數評分（HAQDI）為1.8±0.3。

此外，研究同期納入80 例在醫院進行健康體檢的志愿者作為對照。本研究經本院倫理委員會審核批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

治療前采集所有RA 患者的全血樣本。采血后輕輕倒轉采血管，混合4～5 次，直立置于室溫、待血液完全凝固（約1 h），1600 g 離心10 min，分離血清。將分離好的血清轉移至單獨的凍存管中，按照每管400～500 μL 分裝好，置于-80 ℃保存待測。

健康對照者的全血樣本采集、處理同RA 患者。

1.3 血清中14-3-3η 蛋白檢測

采用定制的14-3-3η 蛋白ELISA 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）檢測受試者血清中14-3-3η蛋白水平，所有操作過程均按照試劑盒說明書進行。

1.4 治療

RA 患者依據病情及意愿，選擇接受依那西普聯合MTX 或依那西普聯合LEF。45 例選擇依那西普聯合MTX，用藥方案如下：依那西普25 mg/次，每周2 次，肌肉皮下注射；MTX 7.5～20 mg/周，口服，持續24 周。43 例選擇依那西普聯合LEF，用藥方案如下：依那西普25 mg/次，每周2 次，肌肉皮下注射；LEF 20 mg/天，口服，持續24 周。

1.5 治療應答評估

分別于治療前和治療24 周后評估所有RA 患者DAS28（ESR）評分。參考歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）標準，臨床應答定義為相比治療前，治療后DAS28（ESR）評分下降≥1.2 分。

1.6 統計分析

采用SPSS 24.0（IBM，美國）進行數據統計分析，并用GraphPad prism V7.01 進行繪圖。變量以均值±標準差（±s）、中位值（25th～75th 分位值）或頻次（%）的形式描述。組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。連續變量間的關聯采用Spearman 相關性分析。血清14-3-3η 水平對于RA 患者的診斷作用以及對于臨床應答和不應答患者的區分作用采用受試者工作特征曲線（ROC）、曲線下面積（AUC）以及AUC 95%置信區間（CI）進行評估。臨床應答的預測因素采用單元和多元邏輯回歸模型（向前選擇法）進行分析，并計算優勢比（OR）和95%CI。所有檢驗均為雙側檢驗。P＜0.05 為具有統計學意義。

2 結果

2.1 14-3-3η 在RA 患者和健康對照者中表達水平

14-3-3η 在RA 患者中表達量為1.41（0.09～7.24）ng·mL-1，顯著高于其在健康對照者中表達量〔0.04（0.02～0.08）ng·mL-1〕（P＜0.001）。見圖1-A。14-3-3η 區分RA 患者與健康對照者的ROC 曲線下面積AUC 為0.868（95%CI：0.815～0.921），表明血清14-3-3η 水平對于分辨RA 患者與健康對照者有很好的區分作用。見圖1-B。

圖1 RA 患者和健康對照者中14-3-3η 表達差異以及ROC 曲線

2.2 14-3-3η 表達量與臨床特征的關聯分析

14-3-3η 與呈連續變量的臨床特征關聯分析顯示：14-3-3η 表達量與RA 患者病程（P=0.028）、SJC（P=0.003）、CRP（P＜0.001）水平以及DAS28（ESR）評分（P=0.012）呈正相關，見表1；而與患者年齡（P=0.529）、BMI（P=0.829）、TJC（P=0.730）、ESR（P=0.056）、HAQ-DI 評分（P=0.172）無關聯。

此外，14-3-3η 與呈分類變量的臨床特征關聯分析顯示：14-3-3η 表達量（中位值）與ACCP 陽性正相關（P=0.025）；而與RA 患者性別（P=0.762）、RF狀態（P=0.065）、生物制劑治療史（P=0.083）無關聯。見表2。

表1 14-3-3η表達量與臨床特征（連續變量）關聯

表2 14-3-3η 表達量與臨床特征（分類變量）關聯

2.3 14-3-3η 與臨床應答的關聯分析

在接受依那西普治療的RA 患者中，58 例達到臨床應答，30 例未達到臨床應答。臨床應答患者基線期14-3-3η 表達量為4.59（0.14～8.94）ng·mL-1，高于臨床無應答患者基線期14-3-3η 表達量〔0.70（0.05～3.12）ng·mL-1〕（P=0.011）。見圖2-A。表明14-3-3η 高水平與依那西普治療RA 患者高臨床應答相關。

進一步ROC 曲線分析發現，14-3-3η 區分臨床應答患者與無應答患者的AUC 為0.665（95%CI：0.547～0.784），表明14-3-3η 可以在一定程度上預測依那西普治療RA 患者的臨床應答。見圖2-B。

2.4 臨床應答預測因素的單元與多元邏輯回歸分析

圖2 臨床應答和無應答患者血清中14-3-3η 表達水平差異以及ROC 曲線

針對臨床應答預測因素的單元邏輯回歸結果顯示，14-3-3η 表達量〔P=0.021，OR=1.141（1.020～1.277）〕、ACCP 陽性 〔P=0.006，OR=6.187（1.670～22.919）〕和CRP 水平〔P=0.044，OR=1.015（1.000～1.030）〕可預測更高的臨床應答。見表3。

表3 臨床應答的預測因素-單元邏輯回歸

多元邏輯回歸結果顯示，CRP 〔P=0.047，OR=1.128（1.110～1.145）〕和ACCP 陽性〔P=0.022，OR=5.185（1.275～21.090）〕可以獨立預測更高的臨床應答；而14-3-3η 表達量并不是臨床應答的獨立預測因素。見表4。

表4 臨床應答的預測因素-多元邏輯回歸

3 討論

本研究發現：（1）14-3-3η 在RA 患者血清中高表達，進一步ROC 曲線分析顯示，14-3-3η 可以預測RA 高患病風險，且其與RA 患者疾病活動度正相關。（2）14-3-3η 在臨床應答患者中高表達，且ROC 曲線分析表明14-3-3η 可以預測依那西普治療RA 患者更高的臨床應答。

14-3-3η 是一種在真核生物中廣泛表達的高度保守的酸性蛋白，能夠參與信號傳導等多種生理學進程[7，8]。在RA 研究中，RA 患者血清14-3-3η 表達量較健康對照者更高，且14-3-3η 高表達的RA 患者疾病活動度普遍較14-3-3η 低表達患者更高[9]。

另一項研究表明，14-3-3η 濃度在RA 患者血清中明顯升高，提高了炎癥因子如白介素-1 與白介素-6 的水平，并與類風濕因子、ACCP 水平呈正相關[10]。還有研究發現，14-3-3η 在炎性關節疾病患者滑膜液和血清中高表達，且其表達量與已知的RA標記物基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）MMP-1、MMP-3 正相關[4]。以上研究表明，14-3-3η 在RA 患者中高表達，且與RA 患病風險、炎癥水平、疾病活動度正相關；但這些研究均基于歐洲與北美的RA 患者，而在中國RA 患者中14-3-3η 與RA 患病風險、疾病活動度的關聯少有研究。

本研究發現，在中國RA 患者中，14-3-3η 高表達可以預測RA 高患病風險，且與RA 病程、SJC、CRP 水平、ACCP 陽性以及DAS28（ESR）評分正相關。可能的原因是：（1）14-3-3η 能夠推進促炎信號的傳導，如MAPK 信號通路，以及炎性介質的釋放，如白介素-1、白介素-6 等，使炎癥反應增強，從而加重了患者疾病活動度。（2）14-3-3η 可能通過抑制軟骨分化，增加軟骨侵蝕來促進RA 患者骨損傷，從而增加了受累的關節數[11]。（3）由于14-3-3η 水平與RA骨侵蝕程度呈正相關，而RA 病程與骨侵蝕程度也呈正相關，因此14-3-3η 水平與RA 病程呈正相關[11]。

有少數研究發現，14-3-3η 不僅在RA 患者中差異表達，還可以預測患者對治療的應答。在接受傳統DMARD 治療的RA 患者中，14-3-3η 基線期表達量與患者治療一年后臨床緩解率〔DAS28（ESR）≤2.6 分〕呈負相關[12]。同樣，在接受托珠單抗（tocilizumab）治療的RA 患者中，治療前14-3-3η表達量越低，患者治療12 周后臨床緩解率〔DAS28（ESR）≤2.6 分〕更高[13]。

本研究發現，在接受依那西普治療的RA 患者中，基線14-3-3η 水平在應答患者中較無應答患者中更高。這可能歸因于：

（1）本研究與之前研究的終點不同。在既往研究中，研究終點為臨床緩解，即DAS28（ESR）≤2.6分。已知14-3-3η 表達量與RA 疾病活動度正相關，由此得出：基線期14-3-3η 表達量越低，患者疾病活動度更低，DAS28（ESR）評分也更低。因此，患者在治療后更易達到DAS28（ESR）≤2.6 分。而本研究中，臨床應答定義為相比治療前，治療后DAS28（ESR）評分下降≥1.2 分。基線14-3-3η 水平越高的患者疾病活動度越高〔DAS28（ESR）評分越高〕，接受治療后DAS28（ESR）評分下降可能越大，故而基線14-3-3η 水平越高的患者對于治療的應答更高。

（2）14-3-3η 與患者炎癥水平正相關，而TNF抑制劑具有抗炎作用，因此，基線期14-3-3η 水平越高的RA 患者對于TNF 抑制劑抗炎作用的反應可能更高，炎癥水平下降幅度更大，DAS28（ESR）評分降低值更多。

此外還發現，14-3-3η 可以預測，但不能獨立預測更高的臨床應答，這可能由于14-3-3η 能夠通過影響其它獨立影響因素，如CRP、ACCP 等，從而間接地影響RA 患者對于依那西普治療的應答。

本研究初步揭示了14-3-3η 與RA 患者對于依那西普治療應答的關聯，但仍存在一些缺陷：（1）雖然本研究的樣本量對比于大多數其它研究而言較大，但是深入的研究仍需要擴大樣本量來提高統計效能。（2）14-3-3η 在RA 中的分子機制并沒有納入研究。（3）已知14-3-3η 具有一定的炎癥區域特異性，關節滑膜液測定14-3-3η 可能與血清中得出的結果有異，因此，本研究的結果需要在不同的樣本中作進一步驗證[7]。（4）2009/2010 年，ACR/EULAR 已經提出了RA 的新的分類標準，然而本研究使用的仍為1987 年的RA 分類標準，未使用更新版本。

綜上所述，血清14-3-3η 水平與RA 高患病風險及疾病活動度相關，并可以在一定程度上預測RA 患者對依那西普治療的臨床應答。