UPLC 法測定決明子中4 種蒽醌類成分的含量*

朱 琳，張志同，陳 雋，莊曉慶，馬春燕，龔旭東

南通市食品藥品監督檢驗中心，南通 226006

決明子是常用中藥材，也是家喻戶曉的中藥保健食品。《中國藥典》2015 年版一部規定來源為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子[1]。具有清熱明目、潤腸通便的功效。用于治療目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結等癥候。

決明子主要含有蒽醌、萘并吡咯酮、脂肪酸、氨基酸、無機元素等化學成分，其中蒽醌類化合物約占1%[2]。《中國藥典》2015 年版一部采用甲醇回流提取，取濾液蒸干后用稀鹽酸加熱水解，再用三氯甲烷萃取后測定大黃酚及橙黃決明素的含量；其制備方法繁瑣、耗時較長，且使用大量對人體及環境有害的三氯甲烷。本實驗在文獻研究的基礎上，通過單因素試驗優化蒽醌類化合物含量測定中供試液的制備方法，建立決明子中蒽醌類化合物的UPLC 含量測定方法，此為決明子含量測定的改進，為同道提供參考。

1 儀器與材料

橙黃決明素對照品（批號111900-201605，純度98.3%），大黃素對照品（批號110756-201512，純度98.7%），大黃酚對照品（批號110796-201621，純度99.2%），大黃素甲醚（批號110758-201415，純度99.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

決明子藥材主要收購于各藥材市場和產地，經南通市食品藥品監督檢驗中心龔旭東主任中藥師鑒定確認，樣品信息見表1。樣品均粉碎后過50 目篩，置干燥器中備用。

表1 決明子樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

Waters Acquity UPLC BEHC18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫：0 min 60%B，7 min 10%B，10 min 10% B，11 min 60% B，15 min 60% B；檢測波長為284 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.2 mL·min-1；進樣量為2 μL。

橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的理論塔板數分別為9.0×104、2.0×105、2.8×105、3.0×105。色譜圖見圖1。

圖1 （A）供試品溶液和（B）對照品溶液UPLC 圖譜

2.2 對照品溶液制備

采用三維有限元方法分析拔樁受力，樁體單元如圖2所示，樁體橫斷面如圖3所示。考慮樁土間摩擦力是沿程分布的，如果不考慮地下水的作用，則樁體上拔時最大拉應力為3.5 MPa。上拔時最佳著力點應避開樁頭，在距離樁頂約1 m處均勻向上施力，管樁可以被拔出。

精密稱取橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解制成濃度分別為194.5、49.9、299.0、61.0 μg·mL-1的混合對照品貯備液。取貯備液，逐級稀釋為6 個不同濃度的對照品溶液，進樣。橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的回歸方程見表2。

表2 回歸方程、濃度范圍、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

2.3 供試品溶液制備

取決明子粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（10∶1）的混合溶液50 mL，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流1 h（若瓶壁有黏附物，須超聲溶解），再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液即得。同時取決明子粉末，按《中國藥典》2015 年版四部水分測定法第二法（烘干法）進行水分測定。以下計算結果均按干燥品計。

2.4 供試品溶液制備方法考察

2.4.1 甲醇與鹽酸配比考察 取同一批決明子粉末（樣品編號S1）0.5 g，共5 份，分別加入甲醇-鹽酸（10∶0.25）、甲醇-鹽酸（10∶0.5）、甲醇-鹽酸（10∶1）、甲醇-鹽酸（10∶2）、甲醇-鹽酸（10∶3）配比的混合溶液50 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表3。

表3 甲醇與鹽酸配比下提取的各成分含量

甲醇-鹽酸（10∶1）時，達到水解完全，故選擇該配比的混合溶液。

2.4.2 供試品取樣量考察 取同一批決明子粉末（樣品編號S1）0.4、0.5、0.6、0.8 g 共4 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表4。

表4 不同供試品取樣量下測得各成分含量

取樣量為0.5 g 時，提取效率最高，故選擇供試品取樣量為0.5 g。

2.4.3 水解溫度考察 取同一批決明子粉末（樣品編號S1）0.5 g，共3 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在70 ℃、80 ℃、90 ℃水解1 h，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表5。

表5 不同水解溫度提取出各成分的含量

水浴溫度80 ℃時，達到水解完全，故選擇該水解溫度。

2.4.4 水解時間考察 取同一批決明子粉末（樣品編號S1）0.5 g，共3 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別水解0.5、1、1.5 h，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表6。表明1 h 即可完全水解。

2.5 色譜條件優化及方法學考察

2.5.1 柱溫 分別設置為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，其他條件同“2.1”項，結果表明，30 ℃時主要色譜峰分離度及響應值最佳。

表6 不同水解時間提取各成分的含量

2.5.2 流速分別選擇流速0.15、0.20、0.25 mL·min-1，其他條件同“2.1”項，結果表明，流速0.20 mL·min-1時，主要色譜峰分離度較佳。

2.5.3 精密度試驗 取同一批供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，結果表明，橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD 分別為0.8%、0.9%、0.8%、0.8%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗 取同一批供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1”項下色譜條件測定，結果表明，橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD 分別為1.1%、1.9%、1.2%、1.9%，表明供試品溶液在24 h 內基本穩定。

2.5.5 重復性試驗 取同一批決明子粉末（樣品編號S1）約0.25 g，共6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果表明，橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD 分別為1.2%、1.8%、1.3%、1.9%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收試驗 取同一批決明子粉末（樣品編號S1）約0.25 g，共9 份，分別按已知含量的80%、100%、120% 3 個水平精密加入、由對照品貯備液稀釋而來的混合對照品溶液25 mL，再加入甲醇-鹽酸（10∶2）的混合溶液25 mL，其余按“2.3”項下方法制備供試品溶液，計算回收率，結果見表7。

表7 加樣回收率試驗結果（n=9）

2.6 樣品測定

采用《中國藥典》2015 年版一部決明子“含量測定”項下供試品溶液制備方法及本文“2.3”項下供試品溶液制備方法，分別制備之，按“2.1”項下色譜條件測定，并作比較。根據相應線性關系計算樣品中各組分的含量（按干燥品計），結果見表8。

3 討論

3.1 本文采用UPLC 法建立了決明子中4 種蒽醌類成分的含量測定方法，在樣品制備與色譜方法方面較《中國藥典》2015 年版中決明子蒽醌類成分含量測定方法有所改進，具有簡便、快速與準確的優點。分析方法的提升得益于分析儀器與色譜柱性能的進步。實驗所用樣品溶液可以采用較強酸度的甲醇-鹽酸（10∶1）混合溶液，一般的色譜柱是不耐受的，而Waters Acquity UPLC BEH C18（150mm×2.1mm，1.7 μm）色譜柱的pH 范圍為1～12，可以耐受pH 1的強酸，故改進藥典方法有了基礎。

3.2 在“2.1”項色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液色譜相應的位置上均檢出色譜峰，且紫外光譜圖與對照品均一致。初期查閱文獻[3-5]時，有較多文獻表明，在決明子中檢出大黃酸及蘆薈大黃素，而在本次試驗中，在大黃酸對照品相應的保留時間，供試品中未出現色譜峰，而在蘆薈大黃素對照品相應的保留時間檢出色譜峰，但紫外光譜圖與蘆薈大黃素不一致，與橙黃決明素紫外光譜圖較為相似，懷疑與橙黃決明素有相似的結構，其確切結構有待進一步研究。

表8 21 批決明子中不同提取方法所得的各組分含量（%）

3.3 由表8 可知，在21 批樣品中，采用本方法測定的橙黃決明素含量明顯高于《中國藥典》2015 年版一部所測含量結果，大黃酚、大黃素、大黃素甲醚含量均不低于《中國藥典》方法所測結果。

本方法直接采用甲醇-鹽酸（10∶1）的混合溶液加熱水解、提取決明子中蒽醌類組分，簡化了提取步驟，避免了有毒試劑三氯甲烷的使用，且提高了提取效率，操作簡單，重復性好。

3.4 采用了UPLC 法快速檢測決明子中4 種組分的含量，大大節省了分析時間，節約了試劑，且本方法靈敏度、準確度、塔板數等均優于HPLC 法。

3.5 按《中國藥典》提取方法的21 批樣品中，S15號橙黃決明素含量低于藥典中的標準限度，S2、S3、S4、S9、S13、S15、C2、C3、C4 的大黃酚含量低于藥典中的標準限度，不合格率達43%，結果與市場普遍反映的決明子含量測定不合格的現狀相符，具體原因有待深入研究。