清金理嗽丸中苦杏仁苷等7 種成分的HPLC 一測多評法

林維娜，陳海燕

江南大學附屬醫院1 藥學部；2 藥檢科，無錫 214041

清金理嗽丸收載于《衛生部頒藥品標準》中藥成方制劑第10 冊，本方共由12 味藥材組成，主要用于肺熱咳嗽、痰多、氣急嘔吐、口燥等癥的治療。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）[1，2]利用中藥制劑所含成分間的內在函數關系，通過測定一個質量相對穩定、易得的成分，實現方中多個成分的同時測定，具有操作簡便、高效、實用性強、檢驗成本低等優點。本文以黃芩苷為內參物，建立其與苦杏仁苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷和川陳皮素的相對校正因子，通過相對校正因子耐用性考察和對待測成分色譜峰的定位，同時采用一測多評法計算值與外標法實測值的對比，驗證了此一測多評法能同時測定清金理嗽丸中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷和川陳皮素的含量，為提升清金理嗽丸質量提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 藥品與試劑

苦杏仁苷對照品（純度88.2%，批號110820-201808）、黃芩苷對照品（純度95.4%，批號110715-201821）、漢黃芩苷對照品（純度98.5%，批號112002-201702）、黃芩素對照品（純度97.9%，批號111595-201808）、橙皮苷對照品（純度96.2%，批號110721-201818），均由中國食品藥品檢定研究院提供；蕓香柚皮苷對照品（純度99.7%，批號18071023）、川陳皮素對照品（純度99.9%，批號18030541），均為上海同田生物技術股份有限公司產品；清金理嗽丸（每丸重3 g，批號18015602、18015116、18015660，北京同仁堂制藥廠）。乙腈為色譜級，其它試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別精密稱取苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素對照品適量，用70%乙醇分別制成單成分儲備液（經折純計算后各成分質量濃度分別為0.592、3.536、0.704、0.358、0.412、0.474、0.132 mg·g-1），備用；依次精密吸取單成分儲備液各2.0 mL，置20 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液A；再精密吸取混合對照品溶液A 各適量，依次用70%乙醇稀釋2、4、8、16、20 倍，制成混合對照品溶液B、C、D、E、F，備用。

2.1.2 供試品溶液 取清金理嗽丸樣品適量，剪碎，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇[2-4]25mL，稱定重量，加熱回流[4，5]60min，放冷，用70%乙醇補足損失的重量，搖勻，離心5min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按清金理嗽丸的工藝處方，分別制備缺苦杏仁、缺黃芩、缺陳皮枳殼的陰性樣品，再按“2.1.2”項下方法制備3 種陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

采用Welch Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫[2-4]（0～11.0 min，9.0%A；11.0～17.0 min，9.0%A→15.0%A；17.0～31.0 min，15.0%A→38.0% A；31.0～45.0 min，38.0% A→62.0% A；45.0～50.0 min，62.0%A→9.0%A）；檢測波長分別為207 nm（0～17.0 min 檢測苦杏仁苷）[2]、280 nm（17.0～31.0 min檢測黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素）[5]和300 nm（31.0～50.0 min 檢測蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素）[5]；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

在該色譜條件下，待測成分苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素與其他峰均能達到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數按各待測成分色譜峰計均不低于3500，陰性樣品對待測成分的定量檢測無干擾。見色譜圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍試驗 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液F～A 各適量，依法進樣檢測，檢測苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素7 個成分色譜峰的峰面積，以所測成分質量濃度c 為橫坐標，峰面積A 為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。見表1。

2.3.2 進樣精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液B，在“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6 次，檢測苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的峰面積，結果所測7 個成分峰面積的RSD 分別為0.86%、1.5%、0.61%、1.0%、0.97%、0.72%、1.2%。

2.3.3 重復性試驗 取同一批次清金理嗽丸樣品適量，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項下色譜條件進樣測定，檢測苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的峰面積，采用標準曲線法計算所測成分的含量。結果所測7 個成分含量的RSD 分別為1.6%、0.49%、1.5%、0.86%、1.6%、1.7%、0.95%。

2.3.4 穩定性試驗 取同一份清金理嗽丸供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、16 h，按“2.2”項下色譜條件進樣，檢測苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的峰面積，結果表明，清金理嗽丸供試品溶液室溫下16 h 內穩定，所測7 個成分峰面積的RSD 分別為0.79%、1.6%、0.66%、1.1%、0.93%、0.80%、1.2%。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的清金理嗽丸適量，剪碎，每份約0.5 g，取9 份，精密稱定，隨機分成3 組，每組3 份，分別按照樣品含量的50%、100%、150%這3 個水平加入另行配制的混合對照品溶液（苦杏仁苷0.178 mg·mL-1、黃芩苷1.242 mg·mL-1、漢黃芩苷0.238 mg·mL-1、黃芩素0.102 mg·mL-1、蕓香柚皮苷0.126 mg·mL-1、橙皮苷0.134 mg·mL-1、川陳皮素0.032 mg·mL-1）1.0 mL 3 份、2.0 mL 3 份、3.0 mL 2 份，再按“2.1.2”項下方法制備加樣供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的峰面積，計算待測成分的加樣回收率，結果平均加樣回收率分別為98.65%、100.00%、99.08%、97.28%、98.29%、99.17%、97.06%；RSD 分別為1.11%、0.57%、0.93%、1.34%、1.20%、0.86%、1.56%；n 均為9。

2.4 一測多評

2.4.1 相對校正因子的計算 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液F～A 各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的峰面積，以黃芩苷為內參物。相對校正因子計算公式：

f內/待=f內/f待=（A內c待）/（A待c內）

其中，A內為內參物黃芩苷的峰面積，c內為內參物黃芩苷的質量濃度，A待為待測成分的峰面積，c待為待測成分的質量濃度。

按公式建立苦杏仁苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的相對校正因子。見表2。

2.4.2 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響 以黃芩苷為內參物，分別考察2 種高效液相色譜儀（Agilent 1100 型高效液相色譜儀、Waters 2695型高效液相色譜儀）和3 種色譜柱（Welch Ultimate XB C18色譜柱、Agilent HC-C18色譜柱、Diamonsi C18色譜柱）對苦杏仁苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素相對校正因子的影響。見表3。

表2 清金理嗽丸中各成分的相對校正因子

2.4.3 待測成分色譜峰的定位 采用相對保留時間值對待測成分色譜峰進行定位，以黃芩苷為內參物，對比考察2 種高效液相色譜儀（色譜儀同“2.4.2”）和3 種色譜柱（色譜柱同“2.4.2”）對苦杏仁苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素相對保留時間值的影響。見表3。

表3 不同色譜儀、不同色譜柱對相對校正因子、相對保留時間的影響

2.5 清金理嗽丸含量測定中一測多評法與外標法的結果比較

取3 個批次的清金理嗽丸適量，按“2.1.2”項下方法制備清金理嗽丸供試品溶液，每個批次平行制備3 份，按“2.2”項下色譜條件，進樣檢測清金理嗽丸樣品中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的峰面積，先采用外標法計算上述7 種成分的含量，再按“2.4.1”項下建立的相對校正因子，根據內參物黃芩苷實測含量，計算其他6 種成分的含量。經SPSS17.0 軟件、采用t 檢驗，分析一測多評法計算值與外標法實測值之間的差異，結果兩組數據間苦杏仁苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素P 值均＞0.05，表明一測多評法計算結果與外標法實測值無明顯差異，見表4。

表4 一測多評法（QAMS）與外標法（ESM）測得的清金理嗽丸中各待測成分的含量（n=3，mg·g-1）

3 討論

3.1 待測成分的選擇

清金理嗽丸由陳皮、黃芩、膽南星、枳殼、桔梗、桑白皮（制）、苦杏仁、知母（制）、麥冬、百部（制）、甘草、朱砂等12 味中藥材加工而成，方中膽南星、陳皮清熱燥濕化痰，為君藥；黃芩、制知母清熱瀉火，桔梗宣肺祛痰，制桑白皮瀉肺平喘，苦杏仁、制百部潤肺止咳，合為臣藥；枳殼理氣行滯，麥冬養陰生津、潤肺清心，朱砂鎮驚安神，合為佐藥；甘草調和諸藥，為使藥。諸藥合用，共達清熱、祛痰、止咳之功效。本實驗參考中藥質量標志物[6]以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥的確定原則，選取方中君藥陳皮、佐藥枳殼所含主要成分蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素，臣藥黃芩所含代表性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素以及臣藥苦杏仁所含代表性成分苦杏仁苷為定量測定成分，采用一測多評法實現同時測定清金理嗽丸中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素的含量，為全面評價清金理嗽丸質量提供數據支持。

3.2 待測成分色譜峰定位方法的選擇

色譜峰的準確定位是確保所建立的一測多評法可行性的基礎，通常采用相對保留時間或保留時間差對色譜峰進行定位。在本實驗中，考察相對保留時間和保留時間差在2 種高效液相色譜儀和3種色譜柱中的重現性，結果保留時間差的數據波動較大，待測成分漢黃芩苷與內參物黃芩苷保留時間差的RSD＞5.0%，而相對保留時間值數據波動較小，待測成分苦杏仁苷、漢黃芩苷、黃芩素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素與內參物黃芩苷相對保留時間的RSD 均＜2.0%。故采用相對保留時間對待測成分色譜峰進行定位。

本實驗建立的方法操作簡捷，重復性好，準確度高，為客觀地評價清金理嗽丸的內在質量提供了較為有力的科學依據。通過方法學驗證，采用一測多評法與外標法同時測定含量并將測定結果進行對比，證明了本實驗方法的科學性及可行性。