CYP2C19 多態(tài)性對(duì)健康志愿者單劑量口服埃索美拉唑PK 的影響*

黃 旭，孫國(guó)先，2，沈怡雯，張宏文，謝利軍，陳 娟，劉 晉，劉 云，丁 黎，孫魯寧**，王永慶**

1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室，南京 210029；2 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，揚(yáng)州 250001

埃索美拉唑是奧美拉唑S 型異構(gòu)體，于2003年在我國(guó)上市銷售。臨床常用于治療胃及十二指腸潰瘍、反流性食管炎和卓-艾綜合征等酸相關(guān)性疾病。本品口服吸收后在肝內(nèi)大約27%經(jīng)CYP3A4 代謝，其余經(jīng)CYP2C19 代謝，并產(chǎn)生3 種非抑酸活性產(chǎn)物排出體外[1]。CYP2C19 是一種重要的藥物代謝酶。CYP2C19 基因位點(diǎn)突變，通常會(huì)引起CYP2C19酶活性降低或升高，從而導(dǎo)致個(gè)體間臨床治療效果的差異[2]。

鑒于埃索美拉唑主要代謝途徑CYP2C19 的基因多態(tài)性[3，4]，本研究通過(guò)比較38 名健康志愿者不同CYP2C19 基因分型的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，初步探討其對(duì)埃索美拉唑藥動(dòng)學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Triple Quad TM 5500 串聯(lián)質(zhì)譜儀，配Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（AB Sciex）；CPA225D 分析天平（Sartorius）；PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀（ABI 公司）；H6-1 微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；SC850凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；3730XL 測(cè)序儀（ABI 公司）。

1.2 藥品與試劑

埃索美拉唑鎂腸溶片，每片40 mg，批號(hào)：ZGGB，阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)。

乙腈為色譜純；醋酸銨為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.3 研究對(duì)象

篩選38 名健康受試者，年齡18～35 歲，體重指數(shù)19～27 kg·m-2，試驗(yàn)前經(jīng)病史詢問(wèn)，既往無(wú)煙酒嗜好，無(wú)藥物過(guò)敏史及既往嚴(yán)重病史；對(duì)埃索美拉唑或質(zhì)子泵抑制劑類藥物或本品不過(guò)敏；體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查（心電圖、血壓、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、病毒學(xué)）未發(fā)現(xiàn)有臨床意義的異常；2 周內(nèi)未服用任何藥物。

試驗(yàn)方案和知情同意書(shū)均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.4 研究方案

38 名受試者禁食10 h，次日早晨空腹口服埃索美拉唑鎂腸溶片40 mg，240 mL 溫開(kāi)水送服，分別于服藥前（0 h）和服藥后1、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.5、4、5、6、7、8、10、12 h，在黃光燈下靜脈采血。每個(gè)血液樣品放置于預(yù)先標(biāo)記好的含肝素鈉的試管中（4 mL/管）。每次取血后在黃光燈下處理和分離血漿；置于超低溫冰箱中保存（溫度控制在-70±10 ℃）。血樣采集后冷藏避光轉(zhuǎn)運(yùn)。服藥后2 h 內(nèi)禁水，4 h 內(nèi)禁食。所采集的全血于4 ℃、3500 r·min-1離心8 min，對(duì)分離出的血漿樣品進(jìn)行分析。

1.5 埃索美拉唑鎂血藥濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1.5.1 色譜條件 選用Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀，Zorbax Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm，Agilent），Security Guard Cariridges C18預(yù)柱（4 mm×3.0 mm，Phenomenex）；流動(dòng)相A：含0.05%甲酸和5 mmoL·L-1醋酸銨的水溶液，流動(dòng)相B：100%甲醇梯度洗脫：A 50%（0～2 min），A 10%（2.3～2.6 min），A 50%（2.8～4.0 min）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積：7 μL（每個(gè)樣品的分析時(shí)間為4 min）。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子方式監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓（IS）：4000 V；溫度：600 ℃；源內(nèi)輔助氣1（GS1，N2）壓力：345 kPa；源內(nèi)輔助氣2（GS2，N2）壓力：379 kPa；氣簾氣（CUR，N2）壓力：276 kPa；碰撞氣（CAD，N2）壓力：9 Unit；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。檢測(cè)離子通道為m/z 346.1→198.1（埃索美拉唑鎂）和m/z 349.1→198.1（d3-埃索美拉唑），解簇電壓（DP）分別為50 V 和55 V，碰撞能量（CE）分別為15 V 和14 V。

1.5.3 血漿樣品處理 精密吸取血漿50 μL 置于1.5 mL 塑料離心管中，加入30 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液（d3-埃索美拉唑）50 μL，振搖1 min 后加入純甲醇220 μg，繼續(xù)強(qiáng)烈振搖10 min，于4000 r·min-1、10 ℃下離心10 min，取上清液20 μL 置于1.5 mL 塑料離心管中，以50%甲醇溶液480 μL 稀釋，密封后充分振搖10 min，精密吸取100 μL 置于進(jìn)樣瓶中進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS）分析。

1.5.4 方法學(xué)驗(yàn)證 參照?qǐng)?bào)道方法作單劑量口服40 mg 血漿中埃索美拉唑鎂濃度測(cè)定的方法學(xué)考察，結(jié)果表明，方法的專屬性好，埃索美拉唑鎂線性范圍為0.500～2000 ng·mL-1（r＞0.99），精密度（RSD）≤15%；準(zhǔn)確度（RE）在±15%的范圍以內(nèi)，平均提取回收率＞90%，血漿樣本低溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性好，符合方法學(xué)生物樣本測(cè)定要求。

1.6 基因分型方法

CYP2C19*2（rs4244285）、CYP2C19*3（rs4244285）測(cè)定采用PCR 擴(kuò)增和測(cè)序的方法，由上海生工生物工程有限公司完成。①提取基因組DNA 用采血針抽取每名受試者靜脈血2 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，充分混勻，從中吸取500 mL 全血，用天根血液基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取基因組DNA。②PCR 引物CYP2C19*2 位點(diǎn)擴(kuò)增的正向引物：TACAACCAGAGCTTGGCAT，反向引物：CCTTGACCTGTTAAACATCCGTA；CYP2C19*3 位點(diǎn)擴(kuò)增的正向引物：ATGCATGCCAAACTCTTTTT，反向引物：CTCCAAAGTGCCTGGATGTC。③PCR 反應(yīng)體系10X Taq Buffer 緩沖液2.5 μL，25 mmol·L-1MgCl22.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，正、反向引物（10 pmol·μL-1）各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，滅菌去離子水加至25 μL。④PCR 擴(kuò)增條件：第一步94 ℃預(yù)變性5 min；第二步94 ℃變性20 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行10 個(gè)循環(huán)；第三步96℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，進(jìn)行36 個(gè)循環(huán)；第四步72℃繼續(xù)延伸5min，并于10 ℃復(fù)性7 min，得到目標(biāo)片段長(zhǎng)度：CYP2C19*2 為476 bp，CYP2C19*3 為679 bp。⑤確定基因型：測(cè)序結(jié)果與人類基因庫(kù)中的CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因序列比對(duì)，確定待測(cè)突變位點(diǎn)上的基因型。

1.7 數(shù)據(jù)處理

埃索美拉唑的血藥濃度用LC-MS/MS 法測(cè)定，色譜圖用Analyst 1.4.2 程序分析，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和藥-時(shí)曲線采用Phoenix WinNonlin 軟件計(jì)算，消除數(shù)率常數(shù)（ke）由血藥濃度對(duì)時(shí)間的半對(duì)數(shù)圖斜率求算；消除半衰期（t1/2）以公式求算：t1/2=0.693/ke；AUC采用梯形法計(jì)算，Tmax和ρmax采用實(shí)測(cè)值。其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)還包括清除率（CL）、表觀分布容積（Vd）。

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，受試者按CYP2C19 代謝型分組，分為EM 組（CYP2C19*1/*1）、IM 組（CYP2C19*1/*2 和CYP2C19*1/*3）和PM組（CYP2C19*2/*2 和CYP2C19*2/*3）。采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05 為顯著性差異。以ρmax、Tmax、AUC0-12h、AUC0-∞、t1/2、CL/F、Vd/F 作為應(yīng)變量，分別以基因型（X1）、性別（X2）分組作為自變量，與每個(gè)應(yīng)變量構(gòu)建線性回歸方程。采用逐步回歸篩選變量方法（后退法），剔除標(biāo)準(zhǔn)P＞0.1，得到以下回歸方程：F=a+b1X1+b2X2。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C19 基因型分布及人口學(xué)數(shù)據(jù)

以38 例受試者PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與人類基因庫(kù)中CYP2C19 基因序列比較，得出基因分型結(jié)果，攜帶CYP2C19*1/*2 基因型的比例最高，達(dá)57.9%；攜帶CYP2C19*2/*3 基因型的比例最低，為5.3%。分布結(jié)果經(jīng)檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。按代謝型分類，屬于IM 組的為26 例，占68.4%；屬于EM 組的為10 例，占26.3%；屬于PM組最少，占5.3%。見(jiàn)表1。

2.2 血藥濃度-時(shí)間曲線

38 例受試者分成3 組代謝型，每組用濃度均值作血藥濃度-時(shí)間曲線圖，見(jiàn)圖1。從圖1 可見(jiàn)，EM組的血藥濃度達(dá)峰時(shí)間明顯早于PM 組，也略早于IM 組，濃度明顯低于PM 組和IM 組。

2.3 不同代謝組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

單劑量口服給藥后，3 個(gè)代謝組Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯示：除Tmax無(wú)顯著差異（P=0.413），其余PK 參數(shù)均有顯著差異（P＜0.05）；對(duì)后者采用Bonferroni 法校正顯著性水平作兩兩比較發(fā)現(xiàn)，PM 和IM 各參數(shù)間，均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；PM 和EM 比較，ρmax、Tmax、AUC0-12h、AUC0-∞、t1/2、均有顯著差異（P＜0.05）；EM 和IM 比較，除Tmax外，其余參數(shù)均有顯著差異（P＜0.05）。不同代謝組PK 參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 不同基因型試驗(yàn)對(duì)象人口學(xué)數(shù)據(jù)

圖1 CYP2C19 不同代謝型的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 CYP2C19 不同代謝組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.4 多元線性回歸分析

多元回歸分析結(jié)果顯示，應(yīng)變量Tmax與自變量年齡和基因型分組均不相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.155、0.012，其余藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與年齡和基因型分組相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 PK 參數(shù)差異的影響因素多元回歸分析

3 討論

本研究顯示，38 例受試者單劑量空腹口服埃索美拉唑鎂腸溶片40 mg 后，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與該藥相同劑量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào)道[5，6]基本一致。

CYP2C19 在中國(guó)人群中有兩個(gè)常見(jiàn)的等位基因變異體，即 CYP2C19*2 和 CYP2C19*3。CYP2C19*2 可導(dǎo)致剪接缺失，CYP2C19*3 引起終止密碼子突變。有報(bào)道稱[7，8]，CYP2C19*2 所致PM 在東方人群中發(fā)生率為75%～85%，CYP2C19*3 所致的PM 為20%～25%。另有文獻(xiàn)證實(shí)[9]，CYP2C19*2和CYP2C19*3 等位基因純合的受試者是CYP2C19底物表型差的慢代謝者，在中國(guó)人群的發(fā)生率為15%～17%。另一個(gè)等位基因變異體CYP2C19*17 編碼的CYP2C19 酶活性增強(qiáng)，在歐洲白人及非洲黑人人群中占15%～25%。但是，中國(guó)人群的突變發(fā)生率僅為0.5%～4%[7]。

本研究采用PCR 擴(kuò)增和測(cè)序的方法，發(fā)現(xiàn)CYP2C19 不同基因型中PM 組受試者2 例，占5.3%。與已發(fā)表的中國(guó)人群結(jié)果不相一致[7]，可能與地區(qū)人群遺傳特征差異及樣本量較少有關(guān)。

由本試驗(yàn)結(jié)果看出，CYP2C19 基因?qū)Σ煌x型埃索美拉唑血藥濃度影響明顯，這從圖1 可見(jiàn)，從服藥后2.5 h 起，3 組間埃索美拉唑的血藥濃度為PM＞IM＞EM，表明CYP2C19 與埃索美拉唑代謝密切相關(guān)。鑒于慢代謝組只有2 人，PK 參數(shù)非正態(tài)分布，3 組代謝型Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)顯示：除Tmax無(wú)顯著差異（P＞0.05），其余PK 參數(shù)均有顯著差異（P＜0.05），這與回歸分析結(jié)果相同。各代謝組進(jìn)一步兩兩比較，在PM/IM 比較中，PK 參數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。EM 和另兩組比較，AUC 與ρmax均差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明空腹?fàn)顟B(tài)下口服埃索美拉唑鎂腸溶片吸收速度及達(dá)峰時(shí)的暴露量不同。EM 和另兩組的t1/2差異顯著（P＜0.05），可見(jiàn)EM 的藥物清除快于IM 和PM。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，性別和基因型分組可對(duì)PK 參數(shù)有影響，線性回歸方程分析認(rèn)為，除Tmax之外，代謝型分組和性別與其它PK 參數(shù)線性相關(guān)（P＜0.05）。因此，依據(jù)基因型分組的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較結(jié)果能夠部分解釋各組代謝類型，這與Hunfeld NG、Lou HY 等[5，10]研究結(jié)果一致。

國(guó)內(nèi)外多個(gè)臨床研究表明[11-13]，埃索美拉唑的療效與CYP2C19 基因型無(wú)關(guān)，在酸控制方面人際差異少。然而，本研究從藥動(dòng)學(xué)角度揭示了CYP2C19 基因多態(tài)性對(duì)PK 參數(shù)的影響，并為臨床療效的差異提供了佐證。由于本研究共入選38 名健康受試者，樣本例數(shù)較少，研究結(jié)果仍需要大樣本的臨床試驗(yàn)來(lái)支持。