麥冬多糖對脂多糖誘導巨噬細胞損傷的保護作用及機制研究*

周夢玲，袁厚宇，吳素玲

1 南京中醫藥大學，南京 210029；2 南京中醫藥大學附屬南京中醫院，南京210001；3 南京市第一醫院，南京 210006

干燥綜合征（sjo¨gren's syndrome，SS）是一種以唾液腺和淚腺炎性細胞浸潤及破壞為特征的慢性炎癥性疾病，可以發展為嚴重的口干癥（口干）和干燥性角膜結膜炎（干眼癥），并可累及多種組織和器官[1]。病原微生物感染導致的慢性炎癥反應在SS 的發生發展中起著重要作用[2]。巨噬細胞作為天然免疫系統重要組成部分，能夠通過殺滅病原體并分泌相關介質、參與免疫調節、干預炎癥進程，但其損傷導致的過度激活又是介導炎癥反應和組織損傷的重要因素[3]。有文獻報道，激活的巨噬細胞能夠滲入角膜基質、角膜緣和淚腺等靶器官中，促進炎癥和組織病變[4]，使淚腺分泌減少，促進干眼癥的形成[5]；巨噬細胞在唾液腺的浸潤以及釋放相關炎性因子，不僅加速腺體損傷，而且增加罹患淋巴瘤的風險[6]。有文獻證實，巨噬細胞衍生的幾丁質酶在損傷干燥綜合征患者的外分泌腺體的過程中起著重要作用，故巨噬細胞功能障礙可能是導致干燥綜合征炎癥反應的重要原因[7]。因此，維持巨噬細胞的穩態是減輕炎癥的有效手段。

麥冬是具有免疫調節作用的中草藥，對機體免疫起著雙向調節作用。麥冬多糖是麥冬重要的組分，現代研究表明，麥冬多糖具有降低血糖、血脂，抗腫瘤、消炎等作用[8]。有文獻報道，麥冬多糖能夠調節水通道蛋白5、血管活性腸肽和降低炎性因子的分泌，對頜下腺起到很好地保護作用[9]。

本文采用脂多糖（LPS）誘導RAW264.7 細胞、構建巨噬細胞損傷模型，探究麥冬多糖對巨噬細胞的保護作用，并初步探索其可能機制，為干燥綜合征藥物的研發提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

微量分析天平（瑞士梅特勒IKA T10）；Bio-Tek多功能酶標儀（Bio-Tek Epoch）；熒光顯微鏡（奧林巴斯BX43）；全自動化學發光凝膠成像分析系統（Bio-Rad Chemi Doc XRS+）；垂直電泳系統（Bio-Rad Mini Protean Terta）；轉膜印跡系統（Bio Mini Trans-Blot）；低溫冰箱（海爾DW-25L262）；臺式離心機（美國貝爾曼）。

1.2 藥品與試劑

DMEN 培養基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、10%胎牛血清（蘇州賽默飛世爾儀器有限公司）；100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素（Beyotime 公司）；脂多糖（LPS，批 號#068M4053V，Sigma 公司）；CCK-8（批號K1018，ApexBio Tech LLC 公司）；麥冬多糖（批號9070-92-3，天津萬象恒源科技公司）；IL-Iβ、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（批號SV1UTPAHR9、ZD2B9RH4JH、DJEI8XA78V，南京納晟生物科技限公司）；MDA、SOD 試劑盒（批號20190327，南京建成生物工程研究所）；GAPDH（批號#5174）、TLR4（批號#14358）、MyD88（批號#4283）、IκBα（批號#4814）、p-IκBα（批 號#2859）、p65（批 號#8242）、p-p65（批 號#3033），以上抗體均購于Cell Signaling Technology公司；75%、95%乙醇、純凈水均自制。

1.3 細胞株

RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），購于上海酶研科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

RAW264.7 細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養液，37 ℃、5%CO2培養，每24～48 h 換液一次，取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.2 CCK-8 篩選LPS、麥冬多糖的濃度

收集對數生長期細胞，以5×104/mL 個接種至96 孔細胞培養板，每孔加入100 μL 細胞懸液，置于5%CO2、37 ℃培養箱，培養24 h，依次加入不同濃度的LPS（每孔0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1），每個濃度設3 個復孔，培養6 h，每孔內加入CCK-8 溶液10 μL，培養2 h，用酶標儀測定各孔在450 nm 處的OD 值。篩選麥冬多糖濃度方法大致同前，設置不同濃度（每孔0、5、10、50、100、500、1000 μg·mL-1），每個濃度設4 個復孔，置于5%CO2、37 ℃培養箱，培養24 h，依次加入不同濃度的含藥培養基100 μL，培養24 h，在每個孔內加入CCK-8 溶液20 μL，培養2 h，用酶標儀測定各孔在450 nm 處的OD 值。

2.3 CCK-8 法檢測麥冬多糖對LPS 誘導的細胞損傷的預保護

收集對數生長期細胞，以5×104/mL 個接種至96孔細胞培養板，每孔加入100 μL 細胞懸液，置于5%CO2、37 ℃培養箱，培養24 h，分為對照組、模型組及麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），對照組、模型組各加入空白培養基100 μL，麥冬多糖低、中、高劑量組依次加入相應濃度的含藥培養基100 μL，每個濃度設4 個復孔，培養24 h；除對照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養6 h，在每個孔內加入CCK-8 溶液20 μL，培養2 h，用酶標儀測定各孔在450 nm 處的OD 值。

2.4 ELISA 試劑盒檢測上清液中的炎性因子含量

將對數生長期細胞以5×104/mL 個接種至6 孔細胞培養板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，細胞貼壁約80%后，分別設置對照組、模型組、麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），培養24 h；除對照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養6 h，收集各組細胞上清液，嚴格按照ELISA 試劑盒操作說明檢測上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

2.5 上清液中MDA 含量和SOD 活力檢測

將對數生長期細胞以5×104/mL 個接種至6 孔細胞培養板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，細胞貼壁約80%后，分別設置對照組、模型組、麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），培養24 h；除對照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養6 h，收集各組細胞上清液，嚴格按照MDA 和SOD 試劑盒操作說明檢測上清液中SOD 活力和MDA 含量。

2.6 Western blot 技術分析蛋白的表達

將對數生長期細胞以5×104/mL 個接種至6 孔細胞培養板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，細胞貼壁約80%后，分別設置對照組、模型組、麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），培養24 h；除對照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養6 h，收集細胞于RIPA 裂解液中提取總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳并轉移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別與TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、GAPDH 抗體孵育，TBST 漂洗5次，每次5 min 后再與辣根過氧化物酶偶聯的抗體反應，膜經TBST 漂洗10 次，每次5 min 后再用增強化學發光法（ECL）作發光試劑顯影，灰度成像軟件測定主帶的光密度值，計算上述蛋白在各組細胞中的表達水平。

2.7 統計學分析

采用GraphPad Prism7.0 統計軟件進行數據的分析處理，數據以均數±標準差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析和t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義；P＜0.01 為差異顯著。

3 結果

3.1 LPS 對巨噬細胞活力的影響

采 用LPS 不同濃度（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1）處理細胞6 h 后，結果顯示，當LPS 濃度達到8 μg·mL-1時，細胞活力顯著降低（P＜0.01），因此本實驗采用8 μg·mL-1作為造模濃度。見圖1。

3.2 麥冬多糖對巨噬細胞活力的影響

實驗結果顯示，與對照組相比，隨著麥冬多糖濃度升高，巨噬細胞活力均無明顯變化，故選取50、100、500 μg·mL-1為麥冬多糖低、中、高3 個劑量。見圖2。

圖2 麥冬多糖對巨噬細胞活力的影響（n=4）

3.3 麥冬多糖對LPS 誘導巨噬細胞損傷的保護作用

實驗結果顯示，與對照組相比，給予濃度為8μg·mL-1的LPS 刺激后，巨噬細胞活力顯著降低（P＜0.01）；采用不同濃度的麥冬多糖預處理24 h 后，細胞活力均有不同程度上升（P＜0.01）。見圖3。

圖3 麥冬多糖對LPS 誘導巨噬細胞損傷的保護作用（n=4）

3.4 麥冬多糖對上清液中炎性因子的影響

實驗結果顯示，與對照組相比，模型組中TNFα、IL-6、IL-1β 含量均顯著升高（P＜0.01）。采用不同濃度的麥冬多糖預處理24 h 后，與模型組相比，麥冬多糖低、中、高劑量組中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量顯著下降（P＜0.05）。見圖4。

圖4 麥冬多糖對上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影響（n=6）

3.5 麥冬多糖對上清液中SOD 和MDA 的影響

實驗結果顯示，與對照組相比，模型組上清液中的SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；采用不同濃度的麥冬多糖預處理24 h 后，與模型組相比，麥冬多糖低、中、高劑量組中SOD 活力升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 麥冬多糖對血清SOD 和MDA 的影響（n=6）

3.6 麥冬多糖對TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關蛋白的影響

實驗結果顯示，與對照組相比，模型組中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表達水平顯著升高，p-IκBα/IκBα 和p-p65/p65 的比值顯著升高，IκBα蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，麥冬多糖低、中、高劑量組中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表達水平均顯著降低，p-IκBα/IκBα和p-p65/p65 比值顯著降低，IκBα 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），p65 蛋白水平無明顯差異。見圖6。

4 討論

圖6 麥冬多糖對TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白的影響（n=6）

炎癥是免疫系統對感染和損傷的有害刺激的生理反應，其通過清除感染和有害因子以便維持組織內環境的穩定性。巨噬細胞作為機體免疫系統的第一道防線，不僅能夠通過不同的模式識別受體吞噬細菌、異物、壞死細胞和碎片，還能起到抗原呈遞作用，激活機體適應性免疫，從而起到防御、組織修復和免疫調節的作用[10]。少量的巨噬細胞死亡有利于巨噬細胞更新炎癥的進程，但大量的巨噬細胞死亡可以導致大量炎性因子及炎性介質的釋放，誘導細胞繼發性壞死，從而加重炎癥反應與組織損傷[11]。因此抑制巨噬細胞的過度活化，防止其損傷對炎癥的緩解尤為重要。

本實驗通過構建LPS 誘導的巨噬細胞損傷模型，觀察麥冬多糖對巨噬細胞的保護作用，結果顯示，LPS 濃度在8μg·mL-1時，巨噬細胞活力出現明顯下降，采用麥冬多糖低、中、高劑量（50、100、500 μg·mL-1）預處理后，均可提高巨噬細胞活力，且麥冬多糖能夠降低IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平而不影響細胞活力。上述結果表明，麥冬多糖能夠提高巨噬細胞活力，減輕巨噬細胞損傷，抑制其活化，減少巨噬細胞IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌。

巨噬細胞活化后能通過合成活性氧（ROS）和活性氮（RNS）而殺滅微生物[12]，但過度的活性氧和活性氮的產生會干擾細胞的代謝和調節，造成細胞損傷，引發IL-6、TNF-α 等炎性因子的釋放[13]。超氧化物歧化酶（SOD）能參與活性氧的代謝，降低氧化應激反應，其能夠間接反映細胞的抗氧化能力[14]，ROS能夠誘導細胞中多不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物丙二醇（MDA），其能夠間接反映ROS 造成的氧化損傷程度[15]。

本研究發現，LPS 誘導后上清液中巨噬細胞SOD 活力降低，MDA 含量升高，采用麥冬多糖預處理后，SOD 活力升高，MDA 含量降低，說明其可以增強巨噬細胞的抗氧化能力，同時降低巨噬細胞中ROS 的分泌，減輕巨噬細胞氧化應激反應。

NF-κB 是一種轉錄因子，在靜息狀態時，其與抑制因子IκBα 組成p65-p50-IκBα 三聚體形式，存在于細胞漿中。Toll 樣受體4（TLR4）能夠在巨噬細胞中表達，其與相應配體結合后，能夠激活接頭蛋白轉導子MyD88，通過級聯信號的傳導，誘導IκBα磷酸化，導致IκBα 的泛素化和降解，并磷酸化激活NF-κB/Rel 復合物，其進而易位至細胞核，誘導靶基因表達，增加ROS、RNS 和促炎細胞因子的產生，加重炎癥反應[16]。

為闡明麥冬多糖對巨噬細胞的保護機制，本研究檢測了麥冬多糖對TLR4/MyD88/NF-κB 的影響，結果顯示，與對照組相比，模型組中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白表達顯著升高，IκBα 蛋白表達顯著下降；采用麥冬多糖預處理后，能升高IκBα 蛋白表達，降低TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表達。諸此表明，麥冬多糖能夠通過抑制TLR4、MyD88 蛋白的表達，并通過抑制IκBα 的磷酸化，阻滯IκBα 的降解，抑制p65 的磷酸化，從而抑制TLR4/MyD88/NF-κB 相關信號通路的激活，減少炎性因子、ROS、RNS 的產生，從而起到保護巨噬細胞的作用。

綜上所述，麥冬多糖對LPS 誘導的巨噬細胞損傷有很好地保護作用，其可能是通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 相關信號通路，減少氧化應激損傷和巨噬細胞炎性因子的分泌，但其深層機制仍需進一步探討。