麥冬多糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

周夢(mèng)玲，袁厚宇，吳素玲

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210029；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，南京210001；3 南京市第一醫(yī)院，南京 210006

干燥綜合征（sjo¨gren's syndrome，SS）是一種以唾液腺和淚腺炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及破壞為特征的慢性炎癥性疾病，可以發(fā)展為嚴(yán)重的口干癥（口干）和干燥性角膜結(jié)膜炎（干眼癥），并可累及多種組織和器官[1]。病原微生物感染導(dǎo)致的慢性炎癥反應(yīng)在SS 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。巨噬細(xì)胞作為天然免疫系統(tǒng)重要組成部分，能夠通過(guò)殺滅病原體并分泌相關(guān)介質(zhì)、參與免疫調(diào)節(jié)、干預(yù)炎癥進(jìn)程，但其損傷導(dǎo)致的過(guò)度激活又是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織損傷的重要因素[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，激活的巨噬細(xì)胞能夠滲入角膜基質(zhì)、角膜緣和淚腺等靶器官中，促進(jìn)炎癥和組織病變[4]，使淚腺分泌減少，促進(jìn)干眼癥的形成[5]；巨噬細(xì)胞在唾液腺的浸潤(rùn)以及釋放相關(guān)炎性因子，不僅加速腺體損傷，而且增加罹患淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)[6]。有文獻(xiàn)證實(shí)，巨噬細(xì)胞衍生的幾丁質(zhì)酶在損傷干燥綜合征患者的外分泌腺體的過(guò)程中起著重要作用，故巨噬細(xì)胞功能障礙可能是導(dǎo)致干燥綜合征炎癥反應(yīng)的重要原因[7]。因此，維持巨噬細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是減輕炎癥的有效手段。

麥冬是具有免疫調(diào)節(jié)作用的中草藥，對(duì)機(jī)體免疫起著雙向調(diào)節(jié)作用。麥冬多糖是麥冬重要的組分，現(xiàn)代研究表明，麥冬多糖具有降低血糖、血脂，抗腫瘤、消炎等作用[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，麥冬多糖能夠調(diào)節(jié)水通道蛋白5、血管活性腸肽和降低炎性因子的分泌，對(duì)頜下腺起到很好地保護(hù)作用[9]。

本文采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞、構(gòu)建巨噬細(xì)胞損傷模型，探究麥冬多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探索其可能機(jī)制，為干燥綜合征藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

微量分析天平（瑞士梅特勒IKA T10）；Bio-Tek多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek Epoch）；熒光顯微鏡（奧林巴斯BX43）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad Chemi Doc XRS+）；垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad Mini Protean Terta）；轉(zhuǎn)膜印跡系統(tǒng)（Bio Mini Trans-Blot）；低溫冰箱（海爾DW-25L262）；臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)貝爾曼）。

1.2 藥品與試劑

DMEN 培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、10%胎牛血清（蘇州賽默飛世爾儀器有限公司）；100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素（Beyotime 公司）；脂多糖（LPS，批 號(hào)#068M4053V，Sigma 公司）；CCK-8（批號(hào)K1018，ApexBio Tech LLC 公司）；麥冬多糖（批號(hào)9070-92-3，天津萬(wàn)象恒源科技公司）；IL-Iβ、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（批號(hào)SV1UTPAHR9、ZD2B9RH4JH、DJEI8XA78V，南京納晟生物科技限公司）；MDA、SOD 試劑盒（批號(hào)20190327，南京建成生物工程研究所）；GAPDH（批號(hào)#5174）、TLR4（批號(hào)#14358）、MyD88（批號(hào)#4283）、IκBα（批號(hào)#4814）、p-IκBα（批 號(hào)#2859）、p65（批 號(hào)#8242）、p-p65（批 號(hào)#3033），以上抗體均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；75%、95%乙醇、純凈水均自制。

1.3 細(xì)胞株

RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），購(gòu)于上海酶研科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每24～48 h 換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 篩選LPS、麥冬多糖的濃度

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104/mL 個(gè)接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，依次加入不同濃度的LPS（每孔0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1），每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)6 h，每孔內(nèi)加入CCK-8 溶液10 μL，培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 處的OD 值。篩選麥冬多糖濃度方法大致同前，設(shè)置不同濃度（每孔0、5、10、50、100、500、1000 μg·mL-1），每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，依次加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h，在每個(gè)孔內(nèi)加入CCK-8 溶液20 μL，培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 處的OD 值。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)麥冬多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的預(yù)保護(hù)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104/mL 個(gè)接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，分為對(duì)照組、模型組及麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），對(duì)照組、模型組各加入空白培養(yǎng)基100 μL，麥冬多糖低、中、高劑量組依次加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；除對(duì)照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養(yǎng)6 h，在每個(gè)孔內(nèi)加入CCK-8 溶液20 μL，培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 處的OD 值。

2.4 ELISA 試劑盒檢測(cè)上清液中的炎性因子含量

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×104/mL 個(gè)接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁約80%后，分別設(shè)置對(duì)照組、模型組、麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），培養(yǎng)24 h；除對(duì)照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養(yǎng)6 h，收集各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

2.5 上清液中MDA 含量和SOD 活力檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×104/mL 個(gè)接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁約80%后，分別設(shè)置對(duì)照組、模型組、麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），培養(yǎng)24 h；除對(duì)照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養(yǎng)6 h，收集各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照MDA 和SOD 試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)上清液中SOD 活力和MDA 含量。

2.6 Western blot 技術(shù)分析蛋白的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×104/mL 個(gè)接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁約80%后，分別設(shè)置對(duì)照組、模型組、麥冬多糖低、中、高劑量組（50、100、500 μg·mL-1），培養(yǎng)24 h；除對(duì)照組外，余各組每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞于RIPA 裂解液中提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量。蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別與TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、GAPDH 抗體孵育，TBST 漂洗5次，每次5 min 后再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗體反應(yīng)，膜經(jīng)TBST 漂洗10 次，每次5 min 后再用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）作發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件測(cè)定主帶的光密度值，計(jì)算上述蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01 為差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

采 用LPS 不同濃度（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1）處理細(xì)胞6 h 后，結(jié)果顯示，當(dāng)LPS 濃度達(dá)到8 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），因此本實(shí)驗(yàn)采用8 μg·mL-1作為造模濃度。見(jiàn)圖1。

3.2 麥冬多糖對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著麥冬多糖濃度升高，巨噬細(xì)胞活力均無(wú)明顯變化，故選取50、100、500 μg·mL-1為麥冬多糖低、中、高3 個(gè)劑量。見(jiàn)圖2。

圖2 麥冬多糖對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響（n=4）

3.3 麥冬多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予濃度為8μg·mL-1的LPS 刺激后，巨噬細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；采用不同濃度的麥冬多糖預(yù)處理24 h 后，細(xì)胞活力均有不同程度上升（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 麥冬多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用（n=4）

3.4 麥冬多糖對(duì)上清液中炎性因子的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中TNFα、IL-6、IL-1β 含量均顯著升高（P＜0.01）。采用不同濃度的麥冬多糖預(yù)處理24 h 后，與模型組相比，麥冬多糖低、中、高劑量組中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量顯著下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 麥冬多糖對(duì)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影響（n=6）

3.5 麥冬多糖對(duì)上清液中SOD 和MDA 的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組上清液中的SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；采用不同濃度的麥冬多糖預(yù)處理24 h 后，與模型組相比，麥冬多糖低、中、高劑量組中SOD 活力升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 麥冬多糖對(duì)血清SOD 和MDA 的影響（n=6）

3.6 麥冬多糖對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關(guān)蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p-IκBα/IκBα 和p-p65/p65 的比值顯著升高，IκBα蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，麥冬多糖低、中、高劑量組中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，p-IκBα/IκBα和p-p65/p65 比值顯著降低，IκBα 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），p65 蛋白水平無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖6。

4 討論

圖6 麥冬多糖對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響（n=6）

炎癥是免疫系統(tǒng)對(duì)感染和損傷的有害刺激的生理反應(yīng)，其通過(guò)清除感染和有害因子以便維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線，不僅能夠通過(guò)不同的模式識(shí)別受體吞噬細(xì)菌、異物、壞死細(xì)胞和碎片，還能起到抗原呈遞作用，激活機(jī)體適應(yīng)性免疫，從而起到防御、組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的作用[10]。少量的巨噬細(xì)胞死亡有利于巨噬細(xì)胞更新炎癥的進(jìn)程，但大量的巨噬細(xì)胞死亡可以導(dǎo)致大量炎性因子及炎性介質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞繼發(fā)性壞死，從而加重炎癥反應(yīng)與組織損傷[11]。因此抑制巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化，防止其損傷對(duì)炎癥的緩解尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷模型，觀察麥冬多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，LPS 濃度在8μg·mL-1時(shí)，巨噬細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯下降，采用麥冬多糖低、中、高劑量（50、100、500 μg·mL-1）預(yù)處理后，均可提高巨噬細(xì)胞活力，且麥冬多糖能夠降低IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平而不影響細(xì)胞活力。上述結(jié)果表明，麥冬多糖能夠提高巨噬細(xì)胞活力，減輕巨噬細(xì)胞損傷，抑制其活化，減少巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌。

巨噬細(xì)胞活化后能通過(guò)合成活性氧（ROS）和活性氮（RNS）而殺滅微生物[12]，但過(guò)度的活性氧和活性氮的產(chǎn)生會(huì)干擾細(xì)胞的代謝和調(diào)節(jié)，造成細(xì)胞損傷，引發(fā)IL-6、TNF-α 等炎性因子的釋放[13]。超氧化物歧化酶（SOD）能參與活性氧的代謝，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，其能夠間接反映細(xì)胞的抗氧化能力[14]，ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中多不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醇（MDA），其能夠間接反映ROS 造成的氧化損傷程度[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)后上清液中巨噬細(xì)胞SOD 活力降低，MDA 含量升高，采用麥冬多糖預(yù)處理后，SOD 活力升高，MDA 含量降低，說(shuō)明其可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗氧化能力，同時(shí)降低巨噬細(xì)胞中ROS 的分泌，減輕巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)時(shí)，其與抑制因子IκBα 組成p65-p50-IκBα 三聚體形式，存在于細(xì)胞漿中。Toll 樣受體4（TLR4）能夠在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其與相應(yīng)配體結(jié)合后，能夠激活接頭蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)子MyD88，通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)IκBα磷酸化，導(dǎo)致IκBα 的泛素化和降解，并磷酸化激活NF-κB/Rel 復(fù)合物，其進(jìn)而易位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，增加ROS、RNS 和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)[16]。

為闡明麥冬多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，本研究檢測(cè)了麥冬多糖對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白表達(dá)顯著升高，IκBα 蛋白表達(dá)顯著下降；采用麥冬多糖預(yù)處理后，能升高IκBα 蛋白表達(dá)，降低TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表達(dá)。諸此表明，麥冬多糖能夠通過(guò)抑制TLR4、MyD88 蛋白的表達(dá)，并通過(guò)抑制IκBα 的磷酸化，阻滯IκBα 的降解，抑制p65 的磷酸化，從而抑制TLR4/MyD88/NF-κB 相關(guān)信號(hào)通路的激活，減少炎性因子、ROS、RNS 的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)巨噬細(xì)胞的作用。

綜上所述，麥冬多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷有很好地保護(hù)作用，其可能是通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB 相關(guān)信號(hào)通路，減少氧化應(yīng)激損傷和巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌，但其深層機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。