氨基葡萄糖生物制造關(guān)鍵技術(shù)研究

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)是葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代后的衍生物，又稱作N-乙酰-D-葡萄糖胺，化學(xué)名為2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。 N-乙酰氨基葡萄糖在酸性條件下可脫去乙酰基轉(zhuǎn)化為氨基葡萄糖。 氨基葡萄糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域，具有較大的市場(chǎng)需求。

目前，N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)方法主要為甲殼素水解法， 通過(guò)使用強(qiáng)酸對(duì)生物中的甲殼素進(jìn)行酸解，使其相互連接的β 鍵斷裂，從而解離出N-乙酰氨基葡萄糖單體。 該方法存在強(qiáng)酸廢液污染環(huán)境、水解條件強(qiáng)烈、蝦殼蟹殼來(lái)源造成部分人群過(guò)敏等缺陷。 微生物發(fā)酵法是利用微生物代謝來(lái)合成GlcNAc，并將目標(biāo)產(chǎn)物分泌到發(fā)酵液中的方法。 如Kim、Jin-Yeon 等（2019）通過(guò)代謝工程構(gòu)建重組谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）。為了構(gòu)建產(chǎn)生GlcNAc 的基礎(chǔ)菌株，分別從谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生菌株13032 中刪除編碼N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脫氨酶和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構(gòu)酶的基因nagA、nagB和nanE，重組菌株被命名為KG208。 此外，分別源自谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母的編碼葡糖胺-6-磷酸合酶和葡糖胺-6-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因glmS和gna1在幾種表達(dá)載體中表達(dá)。 在glmS和gna1表達(dá)的幾種組合中，在ilvC啟動(dòng)子控制下表達(dá)glmS和gna1的重組細(xì)胞在燒瓶培養(yǎng)物中產(chǎn)生1.77 g/L的GlcNAc 和0.63 g/L 的GlcNAc。 JP19990329648 涉及具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（GlmU）活性的多肽，編碼該多肽的DNA。 根據(jù)該發(fā)明，通過(guò)遺傳重組技術(shù)能夠大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)自屬于谷氨酸棒桿菌屬的微生物的GlmU 多肽。 通過(guò)使用該酶，可以有效地生成尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺。 Jiang Zhu 等（2018）開發(fā)了一種全細(xì)胞生物催化過(guò)程，用于從N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）環(huán)境友好地合成氨基葡萄糖（GlcN）。其通過(guò)表達(dá)來(lái)源于極端嗜熱古菌的幾丁二糖脫乙酰酶（Dac）構(gòu)建了重組大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌株作為有效的全細(xì)胞生物催化劑。為了增強(qiáng)GlcN 產(chǎn)生，最佳反應(yīng)條件：枯草芽孢桿菌全細(xì)胞生物催化劑18.6 g/L，溫度40 ℃，pH 7.5，GlcNAc 質(zhì)量濃度50 g/L，反應(yīng)時(shí)間3 h。 在上述條件下，GlcN 的最大質(zhì)量濃度為35.3 g/L，3-L 生物反應(yīng)器中的摩爾轉(zhuǎn)化率為86.8%。 鄭昭奕 (2018) 選用了谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)為對(duì)象進(jìn)行代謝路徑改造合成GlcNAc。 該論文主要進(jìn)行了以下工作：1)通過(guò)過(guò)表達(dá)基因glnA對(duì)谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑中加強(qiáng)谷氨酰胺合成途徑表達(dá)， 增強(qiáng)GlcNAc 氨基供體谷氨酰胺合成，重組菌C.gW-SG 的GlcNAc 產(chǎn)量達(dá)到2.34 g/L。通過(guò)敲除基因poxB對(duì)副產(chǎn)物乙酸合成途徑阻斷并將GlcNAc 合成途徑中關(guān)鍵酶基因gna1進(jìn)行整合，重組菌C.gWBG-SGA 的GlcNAc 產(chǎn)量達(dá)到2.62 g/L；2)通過(guò)對(duì)GlcNAc 途徑主要競(jìng)爭(zhēng)途徑中的關(guān)鍵基因pfkA進(jìn)行弱化，采用了anti-sense RNA 和CRISPRi 兩種方式進(jìn)行。 弱化效果最好的是通過(guò)anti-sense RNA 進(jìn)行弱化的菌株C.gWBG-SGAA1 的GlcNAc 產(chǎn)量達(dá)到3.11 g/L；3) 確定了菌株C.gWBG-SGAA41 發(fā)酵過(guò)程中誘導(dǎo)劑最優(yōu)添加時(shí)間和添加濃度分別為接種后2 h 和0.8 mmol/L IPTG。 對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中重要成分進(jìn)行濃度優(yōu)化，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為85 g/L，玉米漿質(zhì)量濃度為40 g/L，尿素質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)最為合適，菌株C.gWBG-SGAA1 達(dá)到4.48 g/L。CN201611001491.7提供了一種生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法，包括如下步驟：以N-乙酰氨基葡萄糖為原料，在工程菌的作用下，生產(chǎn)氨基葡萄糖；所述工程菌為表達(dá)功能蛋白的重組菌，是將編碼所述功能蛋白的功能基因?qū)氤霭l(fā)菌得到的；所述功能蛋白為N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶或幾丁二糖脫乙酰酶。采用該發(fā)明提供的方法制備氨基葡萄糖，反應(yīng)條件溫和、工藝路線簡(jiǎn)單、產(chǎn)物純度高、適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，非常適于推廣應(yīng)用CN201810302095.0 公開了一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒桿菌及其應(yīng)用， 其以谷氨酸棒狀桿菌S9114 作為出發(fā)菌株，使用谷氨酸棒桿菌與大腸桿菌的穿梭表達(dá)載體pJYW-4 表達(dá)了乙酰氨基葡萄糖合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶基因：來(lái)源于秀麗隱桿線蟲來(lái)源的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶GNA1，并通過(guò)在GNA1 基因的3′非翻譯區(qū)插入重復(fù)性回文序列來(lái)加強(qiáng)乙酰氨基葡萄糖合成途徑， 提高乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量，得到了產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組谷氨酸棒桿菌，產(chǎn)量達(dá)到6.1 g/L。

生物法制造氨基葡萄糖具有很多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)環(huán)境污染小、產(chǎn)物得率高、反應(yīng)條件溫和、成本較低、生產(chǎn)時(shí)間較短等，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。 因此開發(fā)并構(gòu)建高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的食品安全級(jí)優(yōu)良生產(chǎn)菌種，創(chuàng)建氨基葡萄糖的綠色高效生產(chǎn)技術(shù)體系，具有重要的意義。