多酚與蛋白質相互作用及其對蛋白質影響

趙鉅陽， 姚恒喆， 石長波

（哈爾濱商業大學 旅游烹飪學院，黑龍江 哈爾濱150028）

關鍵字：多酚；蛋白質；相互作用；結構；性質

作為生命活動的物質基礎，蛋白質不僅提供人體所需營養，同時也具備一定的保健功能[1]。 但蛋白質結構復雜，根據其復雜程度，其結構主要分為一、二、三和四級結構[2-3]。 其性質取決于它的結構，結構受外界因素的影響較大，導致其功能和性質發生極大改變，甚至產生有害物質[4]。 通常蛋白質與食品中的其他分子（如與酚類物質和碳水化合物）之間的相互作用為共價鍵和非共價鍵[5]。

多酚類物質作為天然化合物，廣泛存在于植物細胞中，是植物代謝的次級產物[6]。 多酚類物質種類很多，如酚酸、苯乙酮、苯乙酸、羥基肉桂酸、香豆素、萘醌、氧雜蒽酮、芪、類黃酮等[7]。 富含多酚類的食物具有潛在的積極作用，因此被人們廣泛關注研究。Hollman 等[8]總結了多酚對心血管健康和癌癥的影響，發現多酚在生物體內具有較強的抗氧化活性且抗氧化活性與心血管疾病保護有一定的正相關性。 多酚類物質之所以在生物體中具有潛在的積極作用，是由于其獨特的理化性質，可以與蛋白質、多糖、脂質等大分子結合并產生相互作用，具有與金屬離子絡合、抗氧化性及清除羥自由基等作用[9]。

1 多酚與蛋白質相互作用的機理

目前為止，研究人員對多酚與蛋白質相互作用的機理研究相對較多。 一些體外研究表明蛋白質可與多酚依靠2 種作用力結合，一種為非共價相互作用，另一種為共價結合。 其中非共價主要包括疏水相互作用、范德華力、氫鍵作用力和離子間相互作用[2，10-15]。 如Yuksel 等[10]、Hasni 等[11]、Von Staszewski等[12]的研究中發現，多酚類物質與蛋白質相互作用方式主要為非共價鍵中的疏水相互作用。 田鵬[13]利用熒光光譜法檢測茶多酚與角蛋白的相互結合，設置激發光波長參數為285 nm，激發和發射光狹縫均為10 nm，掃描記錄300～600 nm 的熒光光譜，發現在不同溫度和不同pH 的條件下茶多酚與角蛋白作用力主要是疏水作用， 且溫度和pH 的升高有利于二者疏水結合。 賈晶晶[2]研究發現綠原酸和阿魏酸與β-乳球蛋白結合的相互作用力主要為氫鍵和范德華力，而表沒食子兒茶素與β-乳球蛋白結合的相互作用力主要為疏水相互作用。 Shpigelman 等[14]在實驗中發現加熱的β-乳球蛋白與茶中的表沒食子兒茶素的結合是疏水相互作用和氫鍵的作用。 同樣的，Frazier 等[15]研究結果顯示兒茶素、葡萄籽原花青素等多酚類物質與蛋白質相互結合是由氫鍵造成的。

除了上述的非共價鍵作用力之外，多酚與蛋白質還可以共價鍵的形式相互作用[16]。早在1985 年就有人提出， 酚類物質在一定條件下可以轉化為醌類，并可與蛋白質分子上的親核基團結合形成共價鍵[17-18]。 Ali 等[19]通過實驗證明了咖啡酰奎寧酸和咖啡豆貯藏蛋白之間存在共價鍵。Rohn 等[20]提出酶和多酚之間也存在共價鍵。

然而在這兩類相互作用力中，非共價鍵的結合作用較弱，且不穩定，當環境條件改變時（如溫度、pH 等）會影響二者結合，并可能發生可逆反應，結合物再次分解[21]。 如原花青素與蛋白質的相互作用方式通常認為是非共價鍵形成的， 當溫度升高時，酚類物質被氧化成醌， 易于與蛋白質發生共價結合。 在堿性條件下，蛋白質變性、解離，增加了與多酚物質結合的作用位點，更易形成不可逆的共價鍵[22]。因此，環境條件會嚴重影響多酚與蛋白質相互作用程度。 除了以上2 種作用力，蛋白質與多酚的相 互 作 用 還 會 受 多 酚 自 身 結 構 的 影 響[11，15，23]。Frazier 等[15]發現相對分子質量高的多酚更容易與蛋白質結合。 此外隨著多酚分子上羥基基團數量的增加，與蛋白質的結合能力也會增強[11，23]。

綜上，多酚與蛋白質的相互作用主要為非共價鍵和共價鍵，其中非共價鍵作用占多數。 環境條件改變會導致可逆的非共價鍵向不可逆的共價鍵進行轉化， 進一步加強多酚與蛋白質相互作用程度。共價鍵和非共價鍵可以同時存在相互作用的過程中。

2 多酚與蛋白質相互作用對蛋白質結構和性質的影響

大量研究已經證實了蛋白質與多酚的結合，二者的復合物會影響多酚的生物活性和蛋白質的結構、功能特性，影響酶活性，以及影響蛋白質的氧化性和消化率。

2.1 改變蛋白質的結構和功能特性

已有一些研究表明， 當多酚與蛋白質結合時，其復合產物會阻斷一些必需氨基酸的生成并影響氨基酸的作用。 Rawel 等[24]提出，與大豆蛋白反應的酚酸和類黃酮可能會阻斷蛋白質分子中賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基，從而降低必需氨基酸的含量及賴氨酸和色氨酸的可利用性。 劉勤勤等[25]利用熒光光譜、 紫外-可見光譜和傅里葉變換紅外光譜法就茶多酚與大豆分離蛋白的相互作用機制進行了研究， 發現茶多酚與大豆分離蛋白相互作用較強，并且茶多酚會導致蛋白質的二級結構發生改變。 但并不是所有的蛋白質都會受到酚類物質的影響，如Petzke 等[26]用綠原酸處理β-乳球蛋白，大鼠實驗結果表明二者相互作用不會影響大鼠生長過程中必需氨基酸的含量及蛋白質的品質。 這種矛盾的結論為多酚與蛋白質的結合受到蛋白質種類的影響，也有可能是體外與大鼠體內實驗具有一定差別。

除了上述的影響外，多酚還會影響蛋白質的功能特性。 多酚與大豆蛋白相互作用會對大豆蛋白功能性質產生影響，郭興鳳等[27-28]報道了茶多酚對大豆分離蛋白的凝膠性、 起泡性等功能性質的影響，茶多酚可以提高大豆分離蛋白的起泡性及乳化性。趙玉紅等[29]在研究樟松子酚與明膠和大豆分離蛋白的研究中表明，其復合產物提高了蛋白質的功能穩定性，從而使得變性轉變溫度提高。 此外酚類物質可以提高蛋白質的發泡能力并增強泡沫的穩定性[30-31]。這一性質的改變可將多酚-蛋白質的復合產物進一步應用于食品或其他領域中。

2.2 對蛋白質其他性質的影響

2.2.1 抑制酶活性 關于酶的本質，多數人認為其是由蛋白質組成的， 這種完全由蛋白質構成的酶，稱為單成分酶[32]或簡單蛋白酶[33]，例如纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶等；除蛋白質外，有些酶類還含有非蛋白質成分，屬于結合蛋白，這類酶被稱為雙成分酶[32]，例如乳酸脫氫酶、轉氨酶等。 目前關于多酚與蛋白質相互作用對酶活性影響的研究都集中在多酚與單成分酶的相互作用，例如通過改變蛋白質的結構，進而影響簡單蛋白酶的活性。Rohn 等[20，34]發現一些多酚物質（如綠原酸、咖啡酸等）會通過降低α-胰凝乳蛋白酶與底物的親和力， 進而抑制酶活性，使得蛋白質水解緩慢。 劉睿等[35]發現高粱中原花青素改變蛋白酶的空間結構、相變溫度和熱焓，進而降低酶的活性。

此外，多酚與簡單蛋白酶相互作用可以形成復合物，進而影響蛋白酶活性。孫賀[36]研究了4 種不同種類的多酚物質對生物體內2 種主要的蛋白酶類消化酶——胃蛋白酶和胰蛋白酶活性的影響，結果顯示，多酚與蛋白質復合物的存在會改變蛋白酶所處微環境的極性或疏水性， 改變蛋白酶的結構，從而抑制2 種蛋白酶的活性。 除蛋白酶外，二者相互作用還會影響其他單成分酶的活性，有研究表明α-淀粉酶的某些特性會促進牙菌斑和齲齒的形成。Rawel 等[37]指出，多酚與蛋白質相互作用會形成復合物，因而降低了α-淀粉酶在口腔中的濃度，以達到抑制蛀牙形成。 肖慧芝[38]探討了不同種類的酚酸對α-葡萄糖苷酶活性的影響，研究結果顯示，不同種類的酚酸（如沒食子酸、咖啡酸、單寧酸等）與α-葡萄糖苷酶結合后均抑制了α-葡萄糖苷酶將多糖分解為葡萄糖的能力，其原理是酚酸與α-葡萄糖苷酶結合的過程中， 占據了α-葡萄糖苷酶的活性位點，使糖類物質不能與α-葡萄糖苷酶結合，從而抑制α-葡萄糖苷酶的活性。其中單寧酸的抑制效果最佳， 這可能是由于單寧酸中含有的酚羥基數量較多，更容易與α-葡萄糖苷酶的蛋白質結合位點發生相互作用。 此外，還有研究指出多酚與蛋白質結合后抑制了脂肪酶、糖苷酶的活性，二者結合后會形成惰性酶-多酚復合物從而限制了酶的活性[20，39-41]。

2.2.2 抑制蛋白質氧化性 研究表明，多酚類物質具有一定的抗氧化活性， 在與蛋白質同時存在時，會抑制蛋白質氧化，阻止自由基的形成。呂丹丹等[42]研究發現，核桃多酚能夠提高核桃蛋白質的抗氧化活性，并且游離態多酚的抗氧化活性顯著高于其他結合態多酚。 劉慈坤等[43]研究了茶多酚對草魚肌原纖維蛋白氧化的影響，發現低濃度茶多酚對草魚肌原纖維蛋白氧化具有抑制作用，而高濃度茶多酚對草魚肌原纖維蛋白氧化則具有促進作用。 傳統的蛋白膜具有良好的可降解性和安全性，可以起到隔絕外界環境以延長食品保質期的作用，但其性質不穩定，易被微生物污染。 而王啟明等[44]研究發現，利用多酚的抗氧化性與蛋白質結合形成的保護膜，性質更加穩定，抗菌能力顯著提高。

2.2.3 影響蛋白質消化率 多酚與蛋白質結合會影響蛋白質的消化與胃腸道中的酶。 Petzke 等[45]發現綠原酸會降低乳清蛋白的消化率。 Petzke 等[45]用綠原酸和β-乳球蛋白衍生物喂養大鼠后發現多酚會影響高衍生化水平的蛋白質的總氮消化率，但凈蛋白質利用率保持不變。Rohn 等[46]在大鼠實驗研究中表明，給大鼠喂食加有綠原酸和槲皮素的大豆分離蛋白，會使氮消化率、生物學價值和凈蛋白質利用率受到影響。 由此可發現，多酚與蛋白質結合對不同種類的蛋白質消化率有著不同程度的影響。

除了上述的相互作用影響之外，有研究還表明蛋白質-多酚相互作用可以使口腔產生澀感， 即唾液蛋白和單寧結合并產生相互作用，降低了唾液的潤滑性，從而導致口腔內的不適感[47]。 Shpigelman等[48]的研究表明多酚-蛋白質相互作用可使多酚被傳送到胃腸道的下部，對多酚在胃腸道下部的釋放產生積極作用。

綜上，多酚與蛋白質結合會對蛋白質的結構和性質產生不同程度的影響，這主要與多酚自身結構和多酚物質的種類有關系。 目前為止，對多酚與蛋白質相互作用的研究方向還較窄，因此，需要對其進行深入研究，并將二者結合的特性恰當地應用在日常生活中作為今后主要的研究方向。

3 多酚與蛋白質相互作用的分析方法

由于多酚與蛋白質結合的過程較為繁雜，目前為止，還沒有單獨的技術可以完全說明其相互作用過程，因此，其研究方法一般通過多種技術進行表征[49]。 如熒光光譜法、圓二色光譜法（CD）、傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）、核磁共振波譜法（NMR）、等溫滴定量熱法（ ITC）、粒徑測定法、分子模擬技術、動態光散射（ DLS）平衡透析法、濁度測定法、蛋白質沉淀法、高效液相色譜法等。 本文中綜述了幾種常用且較為常用的表征方法[50-51]。

3.1 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法是一種無損檢測方法，該方法樣品用量少、不受光散射影響，不同狀態、濃度及環境下的蛋白質都可以進行測定。 其原理為通過掃描的光譜提供蛋白質二級結構信息，如蛋白質結構中的結構構象和疏水性等信息[52]。 蛋白質的特征吸收帶主要有酰胺I、I、III 帶，且酰胺I 帶能更好地反應蛋白質的二級結構，因此被廣泛應用于分析多酚與蛋白質的相互作用機制[53-56]。

劉勤勤等[25]利用該方法研究茶多酚與大豆分離蛋白結合的相互作用，得出茶多酚引起大豆分離蛋白的二級結構發生改變。 賈晶晶[2]研究綠原酸、阿魏酸或表沒食子兒茶素沒食子酸酯會使β-乳球蛋白的二級結構發生改變，使得其α-螺旋含量下降，β-折疊和β-轉角的含量增加。 Kanakis[23]、Al-Hanish[57]等也利用傅里葉紅外光譜法分別研究發現茶多酚與乳球蛋白和乳清蛋白結合相互作用改變了蛋白質的二級結構。

雖然傅里葉變換光譜法可以對蛋白質結構進行定量分析，但由于檢測物品一般結構復雜，易出現譜峰重疊的現象， 對實驗結果可能產生干擾，因而很少單獨用來表征蛋白質的二級結構，常與圓二色光譜連用分析多酚與蛋白質復合物的二級結構。

3.2 圓二色譜法

圓二色譜法（CD）是研究蛋白質結構變化既簡便又快捷的方法。 該方法需樣量少，可做到快速無損檢測，可在模擬生理條件的水環境下進行，樣品也無須經過嚴格預處理[58]。 通過對左右圓偏振光吸附的差異及變動的特征，分析蛋白質的結構。 在遠紫外區（190～250 nm）可估算出蛋白質的二級結構含量[59-61]，在近紫外區（250～320 nm）可觀測蛋白質三級結構變化[62-63]。 圓二色譜法常常與其他技術聯用來研究多酚與蛋白質結合過程中的結構變化，可以根據蛋白質CD 譜波峰的移動方向來判斷出多酚與蛋白質是否發生相互作用[49]。

Guo 等[64]在研究黃芩素與酪氨酸酶的相互作用時，利用圓二色譜法得出蛋白質二級結構的變化情況。 此外徐潔瓊[65]利用該方法分析了茶多酚對乳蛋白二級結構的影響；Roqanian 等[66]同樣利用該方法得出了姜黃素、槲皮素和白藜蘆醇與淀粉樣蛋白聚集體結合前后蛋白質二級結構的變化情況；Wallace等[67]利用圓二色譜法檢測蛋白質的二級結構可以區分蛋白質聚集體種類。 賈晶晶[2]利用圓二色譜法分別測定了不同種類的多酚物質與β-乳球蛋白溶液的CD 圖， 結果顯示不同種類的多酚類物質對蛋白質二級結構影響不同。 同時有研究證明，在相同條件下茶多酚與不同種類蛋白質相互作用也會誘導蛋白質的二級結構改變[68]。

3.3 熒光光譜法

熒光光譜法是測定蛋白質與多酚相互作用最為廣泛的方法，具有靈敏度高，選擇性好等優點[50]。由于蛋白質構象的轉變、底物的結合和發色團分子環境的變化會導致其固有熒光的變化，由此可以展示多酚物質與蛋白質相互作用導致蛋白質三級結構變化。 通過熒光的改變可以推演出多酚物質與蛋白質的結合位點，并可以通過分析熒光猝滅過程進一步推斷二者的結合過程[69]。

王團結[70]利用熒光光譜法計算猝滅常數、結合數量、結合常數和自由能，分析出多酚和大豆分離蛋白相互作用的猝滅是靜態猝滅，作用過程是自發產生。 徐潔瓊[65]通過熒光光譜法研究得出幾種茶多酚對β-乳球蛋白及β-酪蛋白的熒光猝滅作用，不同種類的茶多酚物質猝滅作用程度不同，但都是靜態猝滅機制，結合位點為1，均為自發進行。 Hu[71]利用該方法研究了綠原酸與HSA 的特異性結合，判斷出該結合反應是自發的。 周瑞[72]、劉建壘[73]同樣通過熒光光譜分析了多酚與蛋白質相互作用機制。 熒光法可以判斷熒光猝滅類型[74]，結合熱力學參數等方法可以判斷該結合反應是否自發進行，確定結合位置和作用力；測定結合常數和結合位點數，定性描述蛋白質的構象變化。 但熒光發射光譜分析也存在一定的局限性，作為一種局部信號，在蛋白質折疊研究中，熒光無法提供詳細的結構信息，所以需要將熒光變化與圓二色譜、傅里葉變換光譜信號進行共同分析得到結論[75]。

4 展 望

多酚與蛋白質的相互作用的重要性已經被普遍認識。 在食品加工、機體保健等方面的研究也逐日增加。 但其相互作用所得到的結果不完全是有益的，因此其相互作用的影響因素和作用條件有待進一步研究。 并且二者相互作用的檢測過程相對比較復雜，一般需要多種檢測方式和儀器連用才能得到有效的結果。 因此，檢測方法研究上有待進一步加深。 此外，有關多酚與蛋白質的相互作用僅停留在基礎研究方面，針對肉制品加工和烹飪方面的應用研究所見甚少，因此，在加工應用方面還有待進一步深入研究。