高效液相色譜法測定漢源金絲皇菊中3個活性成分的含量

李含春 祁 娟 全維明

（雅安市食品藥品檢驗所，四川 雅安 625000）

菊花為菊科，植物菊的干燥頭狀花序[1]，是我國傳統的常用中藥材之一。根據中醫藥理論，結合現代科學研究，其中綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸為主要活性成分，具有散風清熱，平肝明目，清熱解毒的功效，常用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等。皇菊中的金絲皇菊因其富含綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和其他人體有益物質，具有香、甜、潤三大特點，受到廣泛關注。金絲皇菊以江西、安徽、青海等為主要產地，其中安徽金絲皇菊尤為出名，以口感好、花片厚為特色，為此，雅安市漢源縣從安微歙縣引種金絲皇菊。目前，菊花中亳菊、滁菊、貢菊、杭菊、懷菊都有規范的檢驗標準，而金絲皇菊無正式的產品標準及檢驗標準，為考察金絲皇菊的藥用價值，對金絲皇菊進行了研究，建立了同時測定金絲皇菊中3個活性成分的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定方法，作為質量控制方法之一。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（Agilent公司）；XS205 DualRange電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SCQ-雙頻普通超聲波清洗機（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑：金絲皇菊（水分含量為10.2%）產地為漢源；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817 含量：96.8%）；木犀草苷對照品（Stanford Chemicals-Stanford Analytical Chemicals Inc，批號：CRS-742884，含量：98.85%）；3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸對照品（Stanford Chemicals-Stanford Analytical Chemicals Inc，批號：DFA-222038，含量：98.78%）；甲醇（成都市科隆化學品有限公司，色譜純）、乙腈（成都市科隆化學品有限公司，色譜純），磷酸（成都市科龍化工試劑廠，優級純），水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件。色譜柱：采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），（梯度洗脫0～11 min，10%～18% A；11～30 min，18%～20% A；30～40 min，20% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：348 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液。精密稱取綠原酸對照品15.12 mg、木犀草苷對照品9.64 mg、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸對照品32.45 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅰ（含綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸的質量濃度分別為146.36 μg/mL、95.29 μg/mL、320.54 μg/mL），置10 ℃以下保存備用。精密量取混合對照品溶液Ⅰ25 mL于100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅱ（含綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸的質量濃度分別為36.59 μg/mL、23.82 μg/mL、80.14 μg/mL），置10 ℃以下保存備用。

2.2.2 供試品溶液。稱取金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液，置10 ℃以下保存備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性。精密量取“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅱ和供試品溶液各5 μL，按照“2.1”項下條件進樣，結果見圖1。3個化合物均能完全分離，供試品溶液的雜質對綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸的色譜峰不構成干擾，該方法專屬性良好。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）的HPLC圖

2.3.2 線性關系考察。精密量取“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅰ1、2、5、10、20 mL，分別置于20 mL棕色量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，組成5個不同濃度梯度系列。按照“2.1”項下條件進樣5 μL，以對照品質量濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程（表1）。結果在規定的進樣濃度范圍內，各化合物均呈良好的線性關系。分別以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時，確定其定量下限和檢測下限，結果見表1。

表1 3個活性成分的回歸方程、相關系數和線性范圍、定量下限和檢測下限

2.3.3 精密度試驗。精密量取“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅱ5 μL，按“2.1”項下條件連續進樣6次，記錄各成分的峰面積，結果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD分別為0.2%、0.4%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗。取金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下條件處理后，按“2.1”項下條件分別于0、2、4、6、8、12、16、24 h時間點進樣測定，記錄各成分的峰面積。結果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的平均峰面積分別為321.31、311.92、658.79，RSD分別為0.13%、0.15%、0.09%。結果表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗。按“2.2.2”項下方法，制備供試品溶液4份，按“2.1”項下條件進樣測定，計算各組分的含量。結果測定得四份供試品中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量百分比平均值（n=4）分別為0.4213%、0.2643%、0.7600%，RSD均為0.4%。表明該方法的重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗。稱取3份金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.1 g，精密稱定，分別精密加入“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅰ2.5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，并記錄峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2 金絲皇菊中3個活性成分的加樣回收率

2.4 樣品測定。取金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定4份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取“2.2.1”中配制的混合對照品溶液Ⅱ和供試品溶液各5 μL，按“2.1”項下條件進樣測定，計算得金絲皇菊中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量，結果見表3。

表3 金絲皇菊樣品測定結果

3 討 論

3.1 系統適應性試驗中，3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸對照品的理論塔板數在50000以上；綠原酸色譜峰與木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸色譜峰的分離度分別為49.05、14.68，＞1.5，表明三個待測物質色譜峰完全分離；各峰的拖尾因子分別為1.021、1.034、1.041，且供試品溶液的雜質對所測成分的色譜峰不構成干擾，本方法能同時測定金絲皇菊中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量。

3.2 樣品測定得漢源金絲皇菊的平均含量分別為0.4213%、0.2643%、0.7600%，含量均高于藥典規定，而據呂紫璇等文獻測定得昆侖雪菊、白菊花、野菊花等10種菊花中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量分別在0.131～0.805%、0.092～3.753%、0.284～1.594%[2]，比較這幾種菊花中三種有效物質的含量，漢源金絲皇菊中綠原酸的含量高于雪菊，木犀草苷的含量高于白菊花和野菊花，3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量高于雪菊和野菊花，表明漢源金絲皇菊中含有豐富的有效物質，有益于人體健康。

4 小 結

采用高效液相色譜法對金絲皇菊的主要活性成分進行含量分析，選擇性好，檢測靈敏度高，分離效果好。可為金絲皇菊的含量分析及漢源金絲皇菊的開發利用提供一定的參考依據，有助于建立金絲皇菊檢驗標準，對控制皇菊產品質量，保障產品安全，具有重要的作用。