血友病基因治療的研究進展

劉嘉榆，鄭夢琪，陳 菡，李斌斌，湯 維，章國衛

(杭州師范大學 醫學院，浙江 杭州 311121)

血友病是X性聯隱性遺傳病，是由于凝血因子缺失而導致的凝血障礙。血友病A患者缺失凝血因子VIII(FVIII)，FVIII基因較大(180 kb)且其蛋白結構復雜，血友病B患者缺失凝血因子IX(FIX)，FIX基因相對較小(34 kb)且其蛋白結構較為簡單。基因及蛋白結構的不同導致血友病A和血友病B在疾病的發生、特點以及產生的抑制物的危險程度上都有區別。血友病A患者占血友病患者總數的85%，血友病A重度患者的比例(45%)高于血友病B(35%)，血友病A患者產生中和抗體的比例高于血友病B患者[1]。

隨著基因與載體研究的突破，血友病的基因治療獲得了較大的發展。維持長期高濃度的凝血因子表達是血友病基因治療的主要問題，通過改造凝血因子編碼基因以增加基因表達效率或增強凝血因子活性成為提高基因治療效果的一個重要途徑。應用于基因治療的病毒載體主要包括腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體(LV)，血友病基因治療主要集中于使用腺相關病毒載體和慢病毒載體。同時，基因組編輯工具(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas9)的發展也為基因治療提供了新的手段。本文圍繞治療基因、載體和靶細胞，總結血友病基因治療的研究進展，對血友病基因治療的優勢和風險做綜合性分析。

1 治療基因

1.1 FIX基因 高凝血活性FIX突變體FIX-R338L的發現為血友病B的基因治療提供了新途徑。FIX-R338L發現于一名易栓癥病人，是自然發生的單氨基酸替換的FIX突變體，FIX的338位的精氨酸被亮氨酸替代，導致FIX的催化結構域發生改變，使其在維持相同蛋白表達水平的情況下活性增加到野生型FIX的5～10倍[2]。動物實驗證實利用病毒裝載的FIX-R338L進行血友病B的基因治療可以在降低載體濃度的情況下仍顯著提高FIX活性及其治療效果，從而可降低載體蛋白在血漿中的暴露量，減輕由于載體蛋白而引起的肝臟損傷和免疫反應。2015年，Spark公司報道了以FIX-R338L進行I/II期臨床試驗的結果，以腺相關病毒(AAV)包裝的FIX-R338L(SPK-9001)對10個血友病B病人進行注射，注射劑量為5×1011mg/kg。52周的持續監測中，FIX平均活性為正常的(33.7±18.5)%，9人在治療后沒有發生出血事件，8人完全停止了FIX的輸注[3]。Nathwani等[4]以正常FIX進行的基因治療臨床試驗中，AAV病毒劑量為2×1012vg/kg，FIX的最高活性為12%。病毒劑量下降一個數量級，FIX-R338L可使FIX活性增加，證明該突變體具有較大的臨床應用前景，為血友病的治療研究提供了一個新的方向。

1.2 FVIII基因 過大的基因長度和復雜的蛋白質結構增加包裝和表達FVIII的難度，密碼子優化可提高FVIII的表達水平。FVIII的結構域包括A1-A2-B-A3-C1-C2，刪除B結構域可減少FVIII基因的長度且不影響其活性，使FVIII基因可被病毒載體包裝而應用于基因治療。BioMarin公司使用經密碼子優化的B結構域缺失的人FVIII基因(FVIII-BDD)，以AAV5病毒作為基因載體開展了一項血友病A的I/II期臨床研究[5]，高劑量組的所有7名患者治療后血漿FVIII活性都超過5%，其中6名患者一年內FVIII水平均維持在50%～150%；所有患者都停止了預防性治療所需的FVIII注射，出血事件從治療前的每年16次下降到1次，患者中未發現FVIII抑制物的產生。Miao等[6]發現，與完全刪除B結構域的FVIII相比，保留B結構域中N端的226個氨基酸及其6個天冬氨酸殘基上連接的N-糖基部分能使FVIII的分泌增加10倍；如果同時將A1結構域中309位的苯丙氨酸突變為絲氨酸可進一步增加FVIII的分泌。McIntosh等[7]用包含了6個糖基化位點的17個氨基酸殘基的多肽序列代替226個氨基酸殘基的間隔序列進一步縮短了FVIII基因的長度，使FVIII的表達水平增加了2倍；結合高效的肝特異性啟動子形成的表達框架可更高效地包裝進AAV載體中，在小鼠和猴血友病A模型中形成更高的FVIII表達水平。

Siner等[8]模仿狗FVIII-BDD，將人FVIII-BDD Furin識別序列處的精氨酸突變成組氨酸(hFVIII-R1645H)后，可使單鏈形式的人FVIII-BDD分泌增加到原來的2倍；同時刪除Furin識別位點使FVIII以單鏈形式合成，在體內和體外試驗中都可增加FVIII的分泌[9]。也有研究[10]指出，將位于A1結構域第309位的苯丙氨酸突變為絲氨酸可增加FVIII的分泌。

Doering等[11]在A1和A3結構域引入豬FVIII序列構建了人/豬雜交FVIII表達序列，該表達序列可產生高達人FVIII 10倍的表達量。近期，該團隊通過分子進化學手段對不同動物中的FVIII進行序列比對，利用祖先序列重建(ancestral sequence reconstruction，ASR)技術獲得與人FVIII具有95%同源性的表達能力更強的FVIII表達序列，其FVIII表達水平在血友病A小鼠中顯著增加[12]。

2 載體

2.1 腺相關病毒載體 AAV是一種無包膜、單鏈DNA病毒，具有低免疫原性、長期轉基因表達能力、基本不與宿主染色體整合的特性。Nathwani等[4]首次用AAV8介導血友病B基因治療臨床試驗，實現了長期的基因表達。后續，Spark公司以AAV包裝FIX-R338L[3]，BioMarin公司以AAV5包裝FVIII基因[5]成功進行了血友病的基因治療臨床試驗。

但AAV基因治療還面臨著許多問題，首先，AAV的基因容量只有5 kb左右，需精確設計FVIII編碼序列、優化啟動子及其他必須序列的長度，才可保證FVIII的表達水平。其次，由于AAV中和抗體在人群中廣泛存在，現有的AAV基因治療只對不含或含很少抗AAV中和抗體的血友病患者適用。此外，AAV基因組是非整合的，存在治療基因缺失和在兒童體內基因被稀釋的可能性。抗AAV中和抗體在首次治療之后會產生，通過清除血漿抗體或免疫抑制可達到對產生抗體患者進行治療的目的，但其副作用仍然是需要考慮的問題[13]。從病毒的角度來看，更換不同血清型AAV可以成為解決這一問題的一個方法。Majowicz等[14]在小鼠和非人類靈長類動物中證實在富含AAV5中和抗體的動物中注射AAV1可實現轉移基因的表達。通過改變病毒衣殼蛋白的抗原表位以避免中和抗體的識別也是可采取的一項策略。Tse等[15]運用分子進化學手段分析AAV抗原表位的保守區域并進行突變篩選，獲得新的AAV突變體，可逃避已有AAV中和抗體的攻擊，但仍會在注射后誘發機體產生相應的中和抗體，從而難以應用于二次注射。

2.2 慢病毒載體 作為逆轉錄病毒載體，LV可運載相對較大的基因片段，實現目的基因穩定整合到靶細胞基因組。LV目前被開發用于離體基因治療[16-22]和體內基因治療[23]。運用離體基因治療策略，通過LV將FVIII或FIX基因導入造血干細胞中，結合使用不同的特異啟動子，可實現FVIII和FIX在血小板中儲存并發揮治療作用，或使表達的FVIII或FIX分泌入血漿發揮治療作用[11,24]。LV也可轉導外向生長內皮細胞或B細胞，經移植后在體內表達凝血因子[25-26]。體內基因治療策略中采用靜脈直接注射LV易觸發機體的免疫反應而使LV失活。在小鼠和狗的血友病B模型中，在LV載體中引入抗原遞呈細胞特異表達的microRNA142以抑制治療基因在細胞中的表達，可大大降低免疫反應的發生；通過靜脈注射使LV能穩定地將目的基因轉移到肝臟，選擇肝細胞特異性的啟動子可使轉基因表達嚴格限定于肝細胞[27]。Staber等[28]在用貓免疫缺陷病毒構建的LV中引入桿狀病毒GP64包膜蛋白，使LV具備肝細胞的靶向性；在血友病A小鼠中靜脈注射該病毒實現了FVIII的表達與治療。Miao等[29]通過骨內注射LV成功轉導了骨髓造血干細胞，實現FVIII在血小板中的表達。

2.3 CRISPR/Cas9 在小向導RNA(small guide RNA, sgRNA)的指引下，Cas9蛋白與DNA靶序列鄰近原始間隔區相鄰基序(PAM)的特定位點相互作用并引起DNA雙鏈斷裂(DSB)。 DSB的產生可誘導兩種DNA修復途徑：同源重組修復(HDR)和非同源末端連接重組修復(NHEJ)。利用這兩種修復途徑可實現基因組編輯的目的并應用于基因治療中。CRISPR/Cas9需通過不同的方式導入細胞才能發揮作用，病毒載體仍然是高效率的選擇。在血友病B小鼠中，以腺病毒為載體的CRISPR/Cas9介導的基因導入被證明能實現FIX基因的矯正，恢復小鼠凝血功能。但由腺病毒引發的免疫反應及肝臟毒性仍然是影響治療效果的一個重要問題[30]。相比腺病毒，AAV具有更低的機體免疫反應和肝臟毒性。通過AAV介導也可成功地實現FIX基因編輯與修復[31]。CRISPR/Cas9在基因治療中的臨床應用仍需解決由于脫靶效應而造成的基因突變的風險以及Cas9蛋白過大不易包裝入AAV等問題。

3 靶細胞

3.1 肝細胞 肝臟是凝血因子的主要合成部位，是血友病基因治療的主要靶細胞。已公開報道的成功的血友病基因治療臨床試驗都采用了以肝細胞作為靶細胞，以AAV作為載體的體內基因治療策略[3-5]。利用LV進行靶向肝細胞的基因治療在動物實驗中觀察到了治療效果[27]。Barzel等[32]利用AAV為載體，采用同源重組策略成功地將FIX基因插入到了小鼠肝細胞基因組清蛋白基因后，利用清蛋白的啟動子表達了FIX，該策略不額外導入外源啟動子增加了基因治療的安全性。由于FIX治療基因整合到小鼠基因組中可以長期穩定表達，有研究者嘗試運用基因組編輯技術對肝細胞進行基因矯正以達到治療目的[33]。直接注射病毒載體較易引起機體的免疫反應及對肝臟的毒性作用，且不適于治療產生抑制物的患者。但也有證據表明靶向肝細胞的基因治療具有免疫耐受性，甚至可清除已存在的抑制物[34]。

3.2 造血干細胞及多種血細胞 造血干細胞的自我更新和分化能力能為患者持續提供血細胞。利用整合載體可實現目的基因在造血干細胞基因組中的穩定整合，使治療基因在造血干細胞分化的后代中持續表達。利用組織特異性的啟動子可實現治療基因在不同分化細胞中的特異表達，如使用珠蛋白啟動子可使FIX在紅細胞中表達[35]，使用CD68啟動子可使FVIII在單核細胞中表達[11]，兩者都可在血漿中恢復相應的凝血因子活性，起到促進凝血的治療作用。使用血小板特異的啟動子可使FIX和FVIII在血小板中表達并儲存[36-37]，該基因治療策略的特點是將凝血因子局限在血小板中，只有血小板在出血部位被激活時才釋放出來促進凝血，可提高出血部位的凝血因子局部濃度；由于血小板的隔離作用，血小板FVIII可在抑制物存在的情況下仍發揮促凝血作用，這項策略有可能成為針對已產生抑制物的血友病A患者的基因治療方法。此外，通過LV直接轉導B細胞也可實現FIX在B細胞中的表達[26]。

4 結論

血友病的基因治療在不斷探索中走向成熟，以AAV作為載體的靶向肝臟的基因治療臨床研究展現出極大的應用前景。功能增強的FIX基因突變體FIX-R338L在增強血友病B的基因治療效果方面展現出功效。通過改進FVIII表達框架可提高FVIII表達效率，進一步提高FVIII的表達與活性是使血友病A基因治療最終獲得臨床應用的關鍵；是否可獲得類似FIX-R338L的高活性FVIII突變體仍有待進一步的研究。LV和造血干細胞結合的離體基因治療模式可能成為血友病基因治療的一條重要途徑。靶向血小板表達的FVIII在抑制物存在下仍能起到治療作用，是針對抑制物設計的基因治療策略。基因編輯等新技術的應用也可為血友病的基因治療開辟新的途徑。