大鼠坐骨神經華勒氏變性相關分子通路初步研究

王婷 ，于灝 ，魏侃 ，王寧

（1.沈陽醫學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫學院附屬中心醫院 手外科，遼寧 沈陽 110024；3.手外科研究所；4.骨科）

周圍神經損傷后感覺和運動功能遭到破壞，容易造成傷殘，嚴重降低患者的生活質量，大大增加了人們的經濟負擔[1-3]。所以尋求治療策略必不可少。雪旺細胞(SC)在神經傳導中和軸突再生過程中是必不可少的，在外周神經損傷后，會導致神經脫髓鞘以及軸突再生受損，可能造成周圍神經病變和神經病理性疼痛[4]。它在Wallerian 變性中經歷去分化、脫髓鞘、增殖遷移等一系列過程[5]，形成的Bungner 帶具有引導近端軸突再生的功能[6]。因此，在研究中發現雪旺細胞遷移能力增加即可認為是神經修復過程良好的表現。

在先前的體外實驗中，我們已經了解到添加外源性PLGF 可提高雪旺細胞遷移能力，其中ERK1/2信號通路可能是介導SCs 遷移的重要因素，而AKT信號通路可能是促進SCs 運動的另一種途徑[7]。MEK-ERK 是一種與細胞遷移相關的細胞通路[8]，抑制該通路一般用于抑制腫瘤細胞凋亡保護機制，是一種較受歡迎的抗腫瘤治療策略[9]。它還與細胞周期調控及增殖有關，在免疫系統中MEK/ERK 在適宜抗原刺激下還可以激活增強細胞周期進展和增殖，但過度刺激會誘導細胞周期阻滯[10]。AKT 在細胞生長和存活過程中起著關鍵作用[11]。在外源性神經保護藥物作用下，神經元樣細胞的核及核周區域以及少突膠質細胞和星形膠質細胞可發現高表達的磷酸化AKT[12]。同時有研究發現在中樞神經系統中抑制MEK/ERK 和PI3K/AKT 通路可以導致少突膠質細胞的遷移顯著降低[13]，表明ERK 和AKT 的確有可能對雪旺細胞的遷移產生影響，因此本實驗通過體內實驗將ERK 以及AKT 抑制劑直接作用于神經，進一步證實ERK 及AKT 調節雪旺細胞遷移的能力。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

SD 大鼠30 只作為實驗對象，體重180～220 g，由沈陽醫學院實驗動物中心提供。所有程序均按照動物倫理審查委員會批準的協議進行。0.2%氯胺酮和0.2%地西泮混合溶液，予2.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉，按照無菌原則暴露坐骨神經，以坐骨大孔處即閉孔內肌近端1.0 cm 平面為壓斷界面，使用恒力裝置施加10 N 的力進行壓迫，以壓迫后復夾神經損傷處鼠呈無反應狀態為宜。按說明配置工作液U0126（9903，Cell Signaling） 及 LY294002（9901，Cell Signaling）。此前實驗證實其最適合濃度分別為30μM 和10μM[7]。規定大鼠右肢為實驗組，左肢為對照組。對照組均僅作壓傷處理，實驗組在壓傷處理后使用微量注射器（HAMILT）分別注入飽和量工作液。

1.2 樣本取材

分別于術后 12 h、24 h、3 d、7 d、14 d 各時間點隨機取出3 只大鼠，以空氣栓塞的方法處死，切取雙側神經解合口兩端至少0.5 cm 長的坐骨神經，于-80℃冷凍保存。

1.3 免疫組化化學染色

經脫蠟水化、0.01 M 的PBS 清洗后，正常兔血清封閉30 min 后傾掉，加入p-75 NGF Receptor 重組抗體（EP1039Y，Abcam，美國），在 4℃環境下孵育過夜。第 2 天經 0.01M 的 PBS 清洗，滴加兔 IgG（SA1022，博士德，中國），室溫封閉30 min 后再以經0.01 M 的PBS 清洗。加入新鮮DAB 工作液濕盒封閉，于鏡下監測到合適顯色后水洗，再入蘇木素復染后水洗，最后入酸乙醇分化后水洗，脫水封片。

1.4 組織學評價

應用Image Pro Plus 6.0 分析上述切片p-75 NFR 免疫組化陽性程度及Bungner 帶數量。以平均光密度值[Density(mean)]表達免疫組化陽性程度；以3～5 個連成一線的細胞核作為Bungner 帶來計數。每張切片均于高倍視野下（×200）隨機取3 個視野進行分析計算。

1.5 統計學方法

1.6 Western blot 測定蛋白

1.6.1 細胞樣本全蛋白提取

將組織盡量剪碎，在每1.0 mL 冷Lysis Buffer中加入10μL 磷酸酶抑制劑、1μL 蛋白酶抑制劑和5μL 100 mM PMSF，混勻，冰上保存數分鐘待用。組織塊轉至新的預冷的離心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer。置于4℃搖床平臺上，溫和振蕩15 min，14 000 rpm/min，4℃離心 15 min，取上清為全蛋白提取物。

1.6.2 蛋白定量（Bradford 法）

根據凱基Braford 蛋白含量檢測試劑盒說明書繪制標準曲線，取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭 G250 染液 990 mL，混勻，測定 595 nm OD 值，然后在標準曲線上求所得濃度。

1.6.3 SDS-PAGE 電泳

成層膠聚合后，小心拔去樣品梳子，然后加入lxTris-Gly 的電泳緩沖液。吸取適量樣品上清加入樣品孔中，在樣品旁的孔中加入預染的蛋白Marker，未添加樣品上清的孔中，加入l×SDS 上樣緩沖液保持膠面平衡。電壓開始設置為60 V，當蛋白樣品進入分離膠后，電壓可提高到 90 V。參照預染Marke 的位置，待目的條帶進入凝膠最佳分離區(大約凝膠的2/3)時，停止電泳。預先將轉膜液4℃預冷。托盤上打開轉移盒，靠近陰極側的內面鋪上己經用轉膜緩沖液浸濕的有孔維墊，其上放3 層浸有轉膜緩沖液的Whatman3 MM 濾紙，注意排凈氣泡。小心撬開玻璃板，將膠放置含有轉膜液的托盤內，將含有目的條帶的分離膠切下，用轉膜液浸泡后置于濾紙上。在凝膠上鋪上經甲醇和轉膜液浸濕的NC 膜，膠和膜之間不能存有氣泡，膜、濾紙和凝膠的大小大致相同。在NC 膜上再放兩層浸過轉膜液的Whatman 濾紙，注意排凈氣泡。放上第二塊海綿墊，使整個轉印夾層依次形成“纖維墊-濾紙-凝膠-NC 膜-濾紙-纖維墊”層次，關閉轉印夾，放入轉移槽中，槽中灌滿轉膜液。打開電源，穩流200 mA，120 min。轉膜結束后，取出NC 膜并作好標記，用TBST 洗膜10 min×3 次。

圖1 Bungner 帶形成情況

圖1f 為術后 12 h、1 d、3 d、7 d、15 d 時 p-75 NGFR 半定量表達，可見3d 時p-75 NGFR 的表達達到峰值

圖2 對照組p-ERK1/2 及p-AKT 的表達及Bungner帶的變化情況

圖3 U0126 干預下p-ERK1/2及 p -AKT 的 表 達 及Bungner 帶的變化情況

圖4 U0126+LY294002 干預下 p-ERK1/2 及 p-AKT 的表達及Bungner 帶的變化情況

1.6.4 封閉、抗原抗體反應

封閉：將NC 膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2 h。封閉結束后，用TBST洗膜10 min×3 次。將膜放入含一抗 (ERK (4695，Cell Signaling,USA),p-ERK(4370,Cell Signaling,USA),AKT(4691,Cell Signaling,USA),p-AKT(4060,Cell Signaling,USA) 的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。第2 天取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗10 min×3 次。用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫搖床振蕩反應1～2 h。二抗反應結束后，回收二抗。然后用 TBsT 洗膜 5～10 min×3 次。將 EcL 化學發光試劑盒中的A、B 兩種液體按l∶l 等體積混合，配置成工作液備用。將NC 膜從TBsT 中取出，甩掉多余的液體，將含有蛋白質的膜正面朝上，滴加適量工作液，用保鮮膜覆蓋。使用G:BOX chemiXR5 成像。使用Gel-Pro32 軟件對結果進行灰度分析。

2 結果

2.1 華勒氏變性遠端神經p-75 NGFR 表達

大鼠坐骨神經損傷后遠端各時間點的p-75 NGFR 的表達均呈陽性；隨著時間推移而p-75 NGFR表達逐漸增加（圖1a-e），至3 d 時表達達到峰值（圖1f）。

2.2 Bungner 帶的形成

大鼠坐骨神經損傷后，遠端在損傷后1 d 觀察到Bungner 帶并未廣泛形成，有多處3～5 個細胞核成行排列，Bungner 帶尚處在形成過程中（圖1b）。遠端神經在損傷3 d 后各時間點p-75 NGFR 陽性染色的激活態雪旺細胞高度增值，細胞核呈條帶狀排列形成 Bungner 帶（圖 1c-e）。

2.3 Bungner 帶形成與ERK1/2 及AKT 信號相關

隨著華勒氏變性時間推移，Bunger 帶形成數量增加并伴隨著p-ERK1/2 表達明顯增加，p-AKT 無明顯改變（圖2）；在神經損傷遠端注射MEK 抑制劑U0126（30μM），結果 Bungner 帶形成數量趨勢無明顯改變（圖3）。在神經損傷遠端注射MEK 抑制劑U0126 及 LY294002(10μM)，結果 Bungner 帶形成數量明顯減少（圖4）。

3 討論

大鼠坐骨神經損傷后，神經遠端發生華勒氏變性，雪旺細胞由靜息態被激活，特異性表達p-75 NGFR 經歷去分化、增值，并遷移形成Bungner 帶從而引導軸突再生。本研究中華勒氏變性神經遠端各時間點的p-75 NGFR 表達均呈陽性，客觀反映了華勒氏變性雪旺細胞被激活后p-75 NGFR 的持續表達狀態。在此過程中由起初的激活態雪旺細胞3～5 成行，3 d 后各時間點形成Bungner 帶形成由少至多，這與Vargas 等報道結果相符[14]。

神經損傷華勒氏變性中，Bungner 帶形成數量與p-ERK 表達呈正相關，p-AKT 表達未見明顯改變。但當在神經損傷遠端單獨注射MEK 抑制劑U 0126時，結果顯示Bungner 帶數量未見明顯減少。而同時應用U 0126 及LY 294002 后Bungner 帶形成數量在各時間點明顯減少，說明ERK 信號途徑及PI3K 途徑可能與雪旺細胞遷移相關，并同時參與Bungner 帶形成，其中具體機制有待我們進一步研究。另外，我們觀察到p-ERK 及p-AKT 在抑制劑注射3 d 后逐漸開始表達，這可能與抑制劑在動物體內有效作用時段或有效作用劑量相關。