紫莖澤蘭水提物中化感物質的熱穩定性初探

趙 蕓,楊云海,王凱博,2,嚴曉琦,蘇發武,范黎明,葉 敏*

(1.云南農業大學 云南生物資源保護與利用國家重點實驗室,云南 昆明 650201;2.云南省農業科學院 農業環境資源研究所,云南 昆明 650201)

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)為原產于墨西哥和哥斯達黎加一帶的菊科澤蘭屬多年生草本或半灌木植物,現主要分布于北緯37°至南緯35°范圍內,由于其極強的入侵優勢,已成為一種世界性惡性入侵雜草和重要的檢疫性有害生物[1-4]。紫莖澤蘭嚴重危害入侵地農、林和畜牧業等的發展,造成極大的經濟損失,甚至對人畜健康構成一定的威脅。研究表明,紫莖澤蘭入侵天然草地3年后覆蓋度可達80%以上,牧草減少約70%,牲畜誤食一定量的紫莖澤蘭后,會出現腹瀉、脫毛甚至死亡[5]。在2003年中國國家環保總局和中國科學院發布的《中國第一批外來入侵物種名單》中紫莖澤蘭名列第一位,是我國面臨的重大生態災害物種之一[6,7]。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中,較完整地將化感作用定義為植物或微生物的代謝分泌物對環境中其他植物或微生物有利或不利的作用。植物化感物質主要屬于植物次生代謝產物,可通過地上部分揮發物、淋溶物、枯枝落葉淋溶和根系分泌四條途徑釋放[8,9]。已有大量研究資料表明,紫莖澤蘭能夠成功入侵與其化感作用密不可分[10,11]。紫莖澤蘭自身能分泌有毒的化感物質并釋放到環境中,從而抑制周圍多種植物的生長發育,抑制效應隨化感物質濃度升高而逐漸增強。張學文等[12]研究發現紫莖澤蘭不同部分的化感作用有明顯差異,相同濃度下紫莖澤蘭地上部分水浸提液的化感作用明顯強于地下部分。徐成東等[13]研究了紫莖澤蘭葉片水提液對玉米種子萌發和幼苗生長的影響,結果表明紫莖澤蘭葉水提取液對玉米種子萌發、幼苗鮮重及玉米幼苗的苗高等均有較強的抑制作用。植物化感物質的產生及釋放除與自身特性有關外,還受到多種因素的影響,如光照、礦質養分、水分以及溫度等環境因子。然而,迄今關于植物化感作用與環境因子關系的研究報道較少[14-16]。溫度與植物化感作用關系密切,溫度的效應可分為兩個方面：一方面是溫度對植物化感作用產生影響;另一方面則是在溫度變化的條件下,植物對化感物質的反應或化感物質的作用強度發生變化[17]。

本文以單子葉植物小麥和雙子葉植物綠豆為試驗材料,初步研究了紫莖澤蘭地上部分水提取物在常溫和煮沸兩種情況下對小麥、綠豆種子萌發和幼苗生長的化感作用,以揭示溫度對紫莖澤蘭水提物中化感物質穩定性的影響,為紫莖澤蘭水提物的深入探究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物材料的采集 供試紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)于2018年2月采自昆明市富民縣城郊,取地上部分置于通風處陰干后粉碎，避光備用。

1.1.2 供試植物種子 綠豆(Vignaradiata)、小麥(Triticumaestivum)種子購于昆明市的種子公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫莖澤蘭地上部分水提取液的制備 稱取陰干粉碎的紫莖澤蘭地上部分500 g,按料液比1∶5(w/w)加入蒸餾水,用超聲波水浴(超聲波頻率:35 kHz,功率:500 W)輔助提取30 min后,靜置浸泡24 h,然后過濾得其濾液；再將過濾后的殘渣重復上述操作,合并兩次提取所得的濾液，得到料液比為1∶10(w/w)的紫莖澤蘭地上部分水提液。取2000 mL紫莖澤蘭地上部分水提取液，煮沸1 h,在煮沸過程中用蒸餾水補充蒸發散耗的水分,定容至2000 mL,即得到固液比為1∶10(w/w)的煮沸后水提取液。將上述所得的常溫和煮沸后水提液用旋轉蒸發儀減壓濃縮,將得到的浸膏置于棕色廣口瓶中，于4 ℃冰箱密封保存備用。

1.2.2 紫莖澤蘭水提取物對兩種作物種子萌發和幼苗生長的影響 稱取一定量的紫莖澤蘭地上部分未加熱和煮沸后的水提液浸膏，用蒸餾水進行稀釋,分別配制成濃度為21.10、10.55、2.11 mg/mL的水溶液，保存備用。

化感作用的生物測定指標主要有種子發芽率、幼苗的莖長及根長等[18]。本實驗主要采用燒杯-濾紙法[19,20]進行培養測定。選取籽粒飽滿、大小均勻的小麥和綠豆種子，用75%的酒精浸泡2 min,然后用蒸餾水反復沖洗5次,再用40 ℃左右的溫水浸泡3 min,將種子自然晾干后放置于底部墊有兩層定性濾紙的50 mL燒杯中,在每個燒杯中分別整齊放入小麥或綠豆種子8粒,加入3 mL配制好的各濃度水溶液，使之剛好沒過種子體積的1/3,設相同量的蒸餾水處理為空白對照。用塑料保鮮膜封閉燒杯并用大頭針在每塊保鮮膜上扎孔10個,以保證通氣并減少水分蒸發。將燒杯放入光照培養箱內培養,光照培養箱設置溫度為25.5 ℃,每天光照時間14 h,黑暗時間10 h,光照強度為11000 lx;培養5 d后測定種子的最終發芽率、根長、根數和苗高。本實驗每個處理設6次重復。

1.3 計算方法

1.3.1 植物種子最終萌發率的計算 供試植物種子最終萌發率(GR)的計算按康小武等[21]報道的方法進行,計算公式如下:

上式中:G為發芽終止時全部正常發芽的種子數；T為供試植物的種子總數。

1.3.2 根長、苗高、根數抑制率的計算 紫莖澤蘭地上部分提取物不同濃度水溶液對小麥、綠豆種子根長、苗高和根數的抑制率參照施蕊等[22]報道的方法進行計算,計算公式如下:

上式中：Ti為各濃度提取物處理的觀測值；T0為空白對照的觀測值。IR>0表示具有抑制作用;IR=0表示無作用;IR<0表示具有促進作用。

1.4 數據統計方法

用SPSS 22.0數據處理軟件處理實驗數據,結合LSD檢驗進行單向ANOVA分析,評價處理間的差異顯著性和重復間的離散度。采用Oringin 9.1進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 紫莖澤蘭水提物對小麥和綠豆種子萌發的影響

紫莖澤蘭水提物對小麥和綠豆種子萌發的影響結果分別見表1和表2。試驗結果表明：紫莖澤蘭地上部分水提物在煮沸后對小麥種子萌發的抑制作用有一定的下降趨勢,且隨濃度升高下降趨勢越明顯;當紫莖澤蘭地上部分水提物濃度為2.11 mg/mL時,用常溫和煮沸的水提物處理后小麥種子最終發芽率無明顯差異(P>0.05);用濃度為10.55、21.10 mg/mL的常溫水提物處理小麥種子,其最終萌發率分別為29.17%和0%;在相同濃度下高溫煮沸的水提物處理對小麥種子萌發的抑制作用明顯下降,最終萌發率分別為87.50%和66.67%。由表2可知,兩種處理后的紫莖澤蘭地上部分水提物對綠豆種子萌發沒有抑制作用,發芽率均為100.00%。由此可見,紫莖澤蘭地上部分水提物對單子葉植物小麥種子萌發的化感抑制作用要強于對雙子葉植物綠豆的化感抑制作用;高溫處理對紫莖澤蘭地上部分水提物的化感作用影響較小。

表1 紫莖澤蘭水提物對小麥種子萌發的影響

注:同列數據后附不同大寫字母表示經S-N-K檢驗在P=0.01水平上差異極顯著;同列數據后附不同小寫字母表示經S-N-K檢驗在P=0.05水平上差異顯著。下表與此相同。

表2 紫莖澤蘭水提物對綠豆種子萌發的影響

2.2 紫莖澤蘭水提物對小麥和綠豆幼苗生長的影響

2.2.1 對小麥幼苗生長的影響 由圖1～圖3可知：常溫和煮沸后的紫莖澤蘭地上部分水提物對小麥幼苗生長有不同程度的抑制作用,且抑制率隨水溶液濃度升高而逐漸增強;水溶液中的活性物質經高溫處理后不會失去活性,具有熱穩定性,但抑制活性與未經高溫處理的水提物相比有一定降低,且濃度越高活性下降越顯著。

由圖1可知,經紫莖澤蘭水提物處理的小麥種子在生長分化后,其幼苗長度與提取物濃度總體呈負相關。經2.11、10.55、21.10 mg/mL常溫水提物處理的小麥種子在發芽后第5天的幼苗長度分別為73.32、16.00、0 mm,而經煮沸的水提物處理后幼苗長度分別為78.07、23.03、11.12 mm,與空白對照的幼苗長度98.03 mm相比均有顯著差異(P<0.05)。兩種處理的水提物各濃度間對小麥幼苗的抑制有顯著差異,呈現出隨溶液濃度升高抑制率也升高的趨勢,且常溫的水提物對小麥幼苗莖長的抑制率明顯高于煮沸水提物的抑制率(P<0.05)。

由圖2可知,經紫莖澤蘭水提物處理的小麥胚根長度與小麥幼苗長度的變化有一致性,隨著溶液濃度升高而變短,胚根抑制率隨濃度升高而逐漸增加。經2.11 mg/mL常溫和煮沸水提物處理的小麥胚根長度分別為49.54、27.72 mm,兩者間有顯著差異(P<0.05),與空白對照的胚根長度66.25 mm相比也有明顯差異。在21.10 mg/mL濃度下兩種處理間小麥胚根長度沒有顯著差異(P>0.05),其抑制率均接近100%。

由圖3可知,常溫和高溫處理的水提物在低濃度下會增加小麥胚根的數量,而在高濃度下會抑制小麥胚根的數量。在2.11 mg/mL濃度下兩種溶液處理對小麥幼根數量的抑制率分別為-1.98%和-8.26%,分析原因可能是低濃度水提物處理小麥種子能刺激其分泌促進胚根分裂的激素等。在21.10 mg/mL濃度處理下小麥幼根數顯著減少,經常溫和煮沸水提物處理后的幼根數量抑制率差異不顯著(P>0.05),但與對照相比有顯著差異(P<0.05)。

A表示常溫水提物;B表示煮沸水提物;不同小寫字母表示經S-N-K檢驗在P=0.05水平上差異顯著。下圖與此相同。

圖2 紫莖澤蘭水提物對小麥幼根生長的影響

圖3 紫莖澤蘭水提物對小麥幼根數量的影響

2.2.2 對綠豆幼苗生長的影響 由圖4～圖5可知:常溫和煮沸后的水提物對綠豆幼苗生長有不同程度的抑制作用,說明紫莖澤蘭地上部分水提物中的活性成分不會隨溫度的升高而失去活性,具有熱穩定性;同一濃度下,兩種處理的水提物對雙子葉植物綠豆幼苗生長的抑制率明顯高于對單子葉植物小麥的抑制率;低濃度水提物對綠豆幼苗、幼根長度均有促進作用,而高濃度水提物有抑制作用。

由圖4可知,在2.11 mg/mL濃度下,常溫水提物處理后綠豆幼苗莖長為100.21 mm,煮沸水提物處理后莖長為95.50 mm,莖長抑制率分別為-20.25%和-14.59%,明顯促進了綠豆幼苗的生長。但隨水提物濃度升高,對綠豆幼苗呈現出抑制作用,21.10 mg/mL常溫和煮沸水提物處理后的綠豆幼苗長度分別為0、19.67 mm,與空白對照的幼苗長度83.34 mm相比有顯著差異(P<0.05)。

由圖5可知,紫莖澤蘭地上部分水提物處理的綠豆幼根長度變化與幼苗長度變化具有一致性,均表現為在低濃度下起促進作用而在高濃度下起抑制作用。2.11 mg/mL兩種處理水提物對綠豆幼根根長的抑制率分別為-46.80%和-31.64%,促進作用較綠豆幼苗長度相比更加明顯。在10.55、21.10 mg/mL濃度下,常溫水提物處理后綠豆幼根長度分別為29.59、0 mm,煮沸水提物處理后綠豆幼根長度分別為45.04、18.56 mm。煮沸水提物對綠豆幼苗、幼根的抑制率雖然顯著低于常溫水提物,但仍具有抑制活性,說明水提物中的化感物質具有一定的熱穩定性。

圖4 紫莖澤蘭水提物對綠豆幼苗生長的影響

圖5 紫莖澤蘭水提物對綠豆幼根生長的影響

3 結論與討論

紫莖澤蘭作為世界性惡草之一,廣泛地分布于熱帶、亞熱帶等地區的30多個國家,嚴重地威脅著本土生物多樣性和生態系統,給社會經濟帶來了極大的損失[23]。研究表明,紫莖澤蘭能成功入侵的主要原因是其具有較強的克株異生作用。在自然條件下,紫莖澤蘭地上部分的分泌物經雨水、露水和霧氣等的淋溶作用滴落到周圍環境中,當累積到一定閾值時就會對鄰近的植物產生化感作用,抑制鄰近植物的種子萌發和影響幼苗胚根、胚軸生長,這些不良作用均會使植物的生長發育受到影響,進而失去與惡草的競爭力。張學文等[24]試驗研究結果表明,紫莖澤蘭地上部水提取液的化感抑制作用比地下部水提取液強,用高濃度水提物處理黃瓜種子后,黃瓜幼苗在形態上明顯畸形,胚根短而粗,子葉發生皺縮現象。李惠敏等[25]在研究紫莖澤蘭葉片浸提液對6種豆科植物的化感作用中發現,綠豆、豌豆、大豆的種子萌發和幼苗生長均受到抑制,且受抑制敏感性強于四季豆。本試驗研究結果顯示，紫莖澤蘭地上部分水提取物對小麥、綠豆均有化感抑制作用,但兩種植物的敏感程度有顯著差異;在相同濃度條件下,單子葉植物小麥受紫莖澤蘭的化感抑制作用較雙子葉植物綠豆更敏感；對小麥而言,種子萌發率和幼苗生長指標均隨水提物濃度升高而抑制作用增強,經高濃度21.10 mg/mL水提取液處理后,小麥的種子萌發率、幼苗長度、幼根長度和幼根數量均為0;對綠豆而言,則表現出“低促高抑”的現象,且抑制作用隨水溶液濃度升高而逐漸增強,這與張彭良等[26,27]的研究結果具有一致性。究其原因，紫莖澤蘭的化感作用機制十分復雜,可能存在具有抑制作用的物質,也可能存在具有促進作用的物質,在自然條件下紫莖澤蘭向土壤中釋放的化感物質濃度只有達到了某一有效作用閾值,才會對周圍的植物產生抑制效果[28]。本試驗對紫莖澤蘭的水提物進行高溫處理，發現其仍具有抑制作用,說明水提物中的化感活性成分具有熱穩定性；但紫莖澤蘭水提物經高溫處理后的抑制活性較常溫水提物有所下降,且水提物的濃度越高,抑制活性下降越顯著，分析其原因，可能是在煮沸過程中,紫莖澤蘭水提物中部分具有揮發性的化感物質受熱逃逸,且水提物濃度越高揮發物散失越多[15,16]。這為今后紫莖澤蘭水提物的研究提供了重要的參考依據。