氨氮對河川沙塘鱧胚胎和仔魚的急性毒性研究

劉國興,鄭 友,霍春林,史楊白,丁淑燕,郝 忱,魏萬紅

(1.揚州大學 動物科學與技術學院,江蘇 揚州 225009;2.江蘇省淡水水產研究所,江蘇 南京 210017)

氨氮是水產養殖環境中最常見的污染物之一,其在水中主要以離子氨(NH4+)和非離子氨(NH3)兩種形式存在,兩者之間可以相互轉化,處于動態平衡[1-2]。NH4+對魚類的毒性較小,而NH3具有脂溶性,能穿透細胞膜,進而對魚類產生較強的毒害作用[3]。在高密度集約化的魚類育苗或養殖系統中,魚類的卵膜、排泄物及殘余餌料等有機物經氨化作用產生大量氨氮,影響魚類的生長發育、呼吸代謝和免疫功能,甚至引起魚類暴發性疾病,造成重大的經濟損失[4-5]。

河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)隸屬鱸形目、塘鱧科,俗稱虎頭鯊、慈姑呆子和塘鱧魚等,是我國特有的一種小型經濟魚類,主要分布于長江中下游及沿江各支流、錢塘江水系和閩江水系,偶見于黃河水系[6]。該魚味道鮮美、營養豐富,深受廣大消費者的歡迎,已成為我國水產業極具發展潛力的特色養殖品種[7]。隨著2014年江蘇省淡水水產研究所率先攻克河川沙塘鱧苗種規模化繁育技術難關并創建了具有區域特色的蝦蟹塘套養河川沙塘鱧高效養殖模式,江蘇各地河川沙塘鱧的養殖規模不斷擴大。

近年來,本項目組發現,由于在河川沙塘鱧苗種孵化和幼體培育的整個過程中,通常不換水或僅少量換水,因而水體中氨氮不斷積累,其可能是影響河川沙塘鱧苗種孵化率與存活率，甚至是導致疾病發生的關鍵因素。目前,有關氨氮對河川沙塘鱧毒性作用的研究尚未見報道。因此,我們以河川沙塘鱧為試驗材料,采用96 h半靜水急性毒性測定方法,研究了不同濃度氨氮對河川沙塘鱧胚胎和仔魚的毒性作用,旨在為河川沙塘鱧繁育實踐中的水質管理提供科學依據,同時也為河川沙塘鱧毒理學研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用河川沙塘鱧親魚由江蘇省淡水水產研究所揚中基地提供,挑選體表無損傷、體質健壯、性腺發育良好的個體作為試驗親魚(雌、雄親魚各25尾),體長(107.03±4.45)mm,體質量(40.91±1.78)g,將它們飼養于育種車間的產卵缸中(3 m×1 m×0.6 m)。每日17:00～18:00按體質量的5%～8%足量投喂鮮活淡水糠蝦,次日6:00吸污換水1/3。采用紅外攝像自動記錄系統,全程記錄試驗親魚的各種行為。當觀察到試驗親魚具明顯的發情行為時,采取半干法人工授精,用黃泥漿脫黏。將受精卵置于充氧水中孵化,水溫從自然溫度逐漸升至25 ℃,并保持恒定。隨機挑選形態完好、處于同一發育時期(體節期)的河川沙塘鱧胚胎用作試驗胚胎，胚胎發育分期參照張君等的方法[8]。試驗仔魚為孵化出膜7日齡的河川沙塘鱧。

試驗用水為經過曝氣48 h的自來水,水溫(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超過6 mg/L,氨氮濃度低于0.01 mg/L,自然光照。

試驗藥物NH4Cl(分析純)經105 ℃烘干至恒重,準確稱樣后以試驗用水配制成10 g/L的母液,在試驗時按比例稀釋至所需濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 氨氮對河川沙塘鱧胚胎的急性毒性試驗 試驗分為對照組和試驗組：對照組僅用試驗用水；根據預備試驗結果,按照等對數間距設置試驗組的氨氮濃度梯度,分別為40.00、63.40、100.48、159.24、252.38和400.00 mg/L。對照組和試驗組各濃度梯度均設3個平行,共用21個培養皿(直徑18 cm，高2 cm)。在每個培養皿中放入20枚試驗胚胎,試驗液為350 mL,水溫控制在(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超過5 mg/L。每24 h更換1次試驗液,更換量為100%。試驗期間不充氣,定時檢查試驗胚胎的發育和死亡情況,及時剔除死亡胚胎,準確記錄24 h、48 h、72 h和96 h的死亡枚數。死亡胚胎的判斷標準：胚胎被觸動5 s,胚體無任何反應即定義為死亡[9]。

1.2.2 氨氮對河川沙塘鱧仔魚的急性毒性試驗 根據預備試驗確定的濃度區間,按照等對數間距設置6個試驗濃度組,分別為10.00、15.16、22.97、34.82、52.78和80.00 mg/L,同時設1個對照組,對照組僅用試驗用水。每組3個平行,共用21個玻璃燒杯(容積2000 mL)。在每個玻璃燒杯中放入10尾試驗仔魚,試驗液為1000 mL,水溫控制在(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超過5 mg/L。在試驗前一天停食,在整個試驗期間不投喂、不充氣,每24 h更換1次試驗液,更換量為100%。定時觀察試驗仔魚的活動狀況和死亡情況,及時撈出死亡仔魚,準確記錄24 h、48 h、72 h和96 h的死亡尾數。死亡仔魚的判斷標準：仔魚被觸動5 s,魚體無任何反應即定義為死亡[9]。

1.3 數據處理

使用SPSS 22.0統計軟件處理試驗數據,采用直線內插法求出24 h、48 h、72 h和96 h氨氮的半致死濃度(LC50)。安全濃度(SC)的計算公式[10]:SC=0.1×96 h時的LC50。非離子氨的計算公式[11]:非離子氨濃度=氨氮濃度/[10(pKa-pH)+1],其中pKa=0.09018+2729.92/T(T為絕對溫度,T=273+t℃)。

2 結果與分析

2.1 氨氮對河川沙塘鱧胚胎的急性毒性

氨氮對河川沙塘鱧胚胎的急性毒性試驗結果如表1所示。在同一處理時間下,隨著氨氮濃度的增加,河川沙塘鱧胚胎的死亡率逐漸上升。在同一氨氮濃度條件下,隨著處理時間的延長,河川沙塘鱧胚胎的死亡率逐漸增加。對照組和氨氮濃度為40.00 mg/L時,河川沙塘鱧胚胎在96 h內未見死亡。當氨氮濃度為400.00 mg/L時,河川沙塘鱧胚胎在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率均為100%。

表1 氨氮對河川沙塘鱧胚胎急性毒性的試驗結果

氨氮對河川沙塘鱧胚胎的半致死濃度及安全濃度結果如表2所示。采用直線內插法對表1中的數據進行分析,求出氨氮對河川沙塘鱧胚胎24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為153.02、139.20、123.59和98.13 mg/L,SC為9.81 mg/L;轉化為非離子氨的LC50分別為8.13、7.40、6.57和5.21 mg/L,SC為0.52 mg/L。

表2 氨氮對河川沙塘鱧胚胎的半致死濃度及安全濃度

2.2 氨氮對河川沙塘鱧仔魚的急性毒性

氨氮對河川沙塘鱧仔魚的急性毒性試驗結果如表3所示。對照組和氨氮濃度為10.00 mg/L時,河川沙塘鱧仔魚在96 h內無死亡。隨著氨氮濃度的增加,其對河川沙塘鱧仔魚的毒害作用增強,其死亡率逐漸上升。在同一氨氮濃度條件下,隨著處理時間的延長,河川沙塘鱧仔魚的死亡率逐漸增加。當氨氮濃度為80.00 mg/L時,河川沙塘鱧仔魚在72 h和96 h的死亡率均為100%。

氨氮對河川沙塘鱧仔魚的半致死濃度及安全濃度結果如表4所示。根據表3中的數據,建立24 h、48 h、72 h和96 h的氨氮濃度對數(x)與河川沙塘鱧仔魚死亡率(y)間的直線回歸方程,依據方程求出氨氮對河川沙塘鱧仔魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為54.52、40.63、30.32和26.16 mg/L,SC為2.62 mg/L;轉化為非離子氨的LC50分別為2.90、2.16、1.61和1.39 mg/L,SC為0.14 mg/L。

表3 氨氮對河川沙塘鱧仔魚急性毒性的試驗結果

表4 氨氮對河川沙塘鱧仔魚的半致死濃度及安全濃度

3 討論

3.1 氨氮對河川沙塘鱧胚胎的急性毒性

在水產養殖環境中,氨氮特別容易達到毒性水平,并且作為一種限制因子影響魚類的生長發育和健康水平[12]。有關氨氮對魚類的毒性效應研究較多,但是對魚類早期生活史階段(尤其是魚類胚胎期)的毒性效應研究較少[13]。Broderius等[14]研究發現,在pH值為6.60～8.68、氨濃度為0.236～0.865 mg/L條件下,小口黑鱸(MicropterusdolomieuiLacepede)胚胎至孵化出膜7 d期間仔魚的存活率無明顯變化。據Solbé和Shurben報道[15],在受精24 h內開始暴露試驗,當非離子氨濃度為0.027 mg/L時,虹鱒(Salmogairdneri)受精卵的死亡率超過70%。Barimo和Walsh[16]的研究結果表明,總氨對海灣豹蟾魚(Opsanusbeta)胚胎96 h的LC50為63.6 mmol/L。本試驗結果表明,隨著氨氮濃度的增加和處理時間的延長,河川沙塘鱧胚胎的死亡率均呈現上升趨勢。氨氮對河川沙塘鱧胚胎96 h的LC50為98.13 mg/L,SC為9.81 mg/L;轉化為非離子氨的LC50為5.21 mg/L,SC為0.52 mg/L。因此,在河川沙塘鱧苗種孵化過程中,由于死卵和卵膜等有機物分解導致孵化水體氨氮濃度升高,因而需要加強水質監測, 適時采取水質調控措施,確保孵化水體中氨氮濃度和非離子氨濃度不超過安全濃度,從而提高河川沙塘鱧苗種的孵化率和繁育成效。

3.2 氨氮對河川沙塘鱧仔魚的急性毒性

在本試驗期間,對照組和氨氮濃度為10.00 mg/L時,河川沙塘鱧仔魚在96 h內無死亡。隨著氨氮濃度升高,仔魚的中毒癥狀越發明顯。在中毒初期,仔魚表現為游動急促或上下竄跳,呼吸急促,時而出現痙攣癥狀。隨著中毒時間的延長,魚體向一側傾斜或腹部向上,不能翻轉至正常游泳姿態,游動乏力,呼吸頻率降低。瀕死時,體色變淺,呼吸微弱,游動無力,身體側翻,失去逃避能力。死亡仔魚鰓蓋及口裂張開,魚體僵直,沉入水底。

本試驗結果表明,隨著氨氮濃度的增加和處理時間的延長,氨氮對河川沙塘鱧仔魚的毒害作用增強,其死亡率逐漸上升。氨氮對河川沙塘鱧仔魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為54.52、40.63、30.32和26.16 mg/L,SC為2.62 mg/L;轉化為非離子氨的LC50分別為2.90、2.16、1.61和1.39 mg/L,SC為0.14 mg/L。截至目前,國內外學者在氨氮/非離子氨對仔、稚、幼魚的毒性效應方面開展了大量的研究工作,但由于非離子氨、LC50和SC計算方法以及試驗條件(pH值、溫度、溶解氧、試驗用水和試驗魚的生長發育階段等)各不相同,因此難以對不同學者的研究結果進行確切的比較[17]。因此,筆者選取了計算方法相同、試驗條件相近的相關研究結果與本文研究結果進行比較。據魯增輝等[17]報道,非離子氨對稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)幼魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為3.00、2.79、2.31和2.06 mg/L,SC為0.21 mg/L。郝小鳳等[18]研究發現,非離子氨對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為3.40、2.92、2.51和2.22 mg/L,SC為0.22 mg/L。從上述試驗結果可以看出,雖然同為底層魚類,但河川沙塘鱧仔魚對非離子氨的耐受能力弱于稀有鮈鯽和泥鰍,這可能是由于魚類生活習性差異導致其對非離子氨的耐受性不同。

此外,本研究結果表明,河川沙塘鱧胚胎對氨氮和非離子氨的耐受能力明顯強于仔魚。已有研究表明,海灣豹蟾魚(O.beta)[16]、稀有鮈鯽(G.rarus)[17]胚胎對氨的耐受性亦強于幼魚或成魚,這與本研究結果一致。據Barimo和Walsh[16]報道,氨氮能夠滲透通過卵膜,卵膜可選擇性地滲透氨/銨鹽或通過新陳代謝將氨清除,從而減輕氨對胚胎的毒害作用。

綜上所述,隨著氨氮濃度的增加和處理時間的延長,河川沙塘鱧胚胎和仔魚的死亡率逐漸升高。本研究獲得了氨氮對河川沙塘鱧胚胎和仔魚的急性毒性結果,發現河川沙塘鱧胚胎對氨氮的耐受能力強于仔魚,本研究結果可為河川沙塘鱧繁育實踐中的水質管理和毒理學研究提供科學依據。