一些柿屬樣本遺傳多樣性的SSAP標記分析

曾 明，吳美華，謝 楓，樂美旺，付江凡

(1.江西省農業科學院 園藝研究所,江西 南昌 330200；2.江西省農業科學院 農業經濟與信息研究所,江西 南昌 330200)

柿屬植物(Diospyrosspp.)包含近500個種[1],我國有近70個種和變種[2]。柿(DiospyroskakiL.)作為柿屬最具代表性的栽培樹種,在我國已有2000多年的栽培歷史,各地選育出了繁多的品種。據文獻記載,我國經過整理統計的原產柿品種資源有1058個[3]。在地理上,依秦嶺-淮河一線可簡單劃分為北方柿和南方柿兩大地理種群,但對南北柿遺傳相關性以及在品種起源進化中地位的研究相對較少。

分子標記因其多態性豐富、穩定性好,成為植物種質資源鑒定和遺傳多樣性研究最常用的方法[4-6]。目前,在柿屬植物中已報道的DNA分子標記涉及5大類13種[7],其中基于反轉錄轉座子的分子標記因靈敏度高、基因覆蓋度廣和多態性豐富等特點,尤其適用于種質遺傳多樣性研究和資源品種鑒定[8]。

特異序列擴增多態性(sequence-specific amplification polymorphism, SSAP)標記是一種檢測逆轉座子和與其臨近的酶切位點之間DNA片段擴增多態性的逆轉座子分子標記,它由AFLP改進而來,具有更高的多態性[9-11]，它已被廣泛應用于植物種質鑒定、遺傳多樣性評價、系統進化研究、遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構建等許多領域[12-14]。杜曉云等利用開發的SSAP引物,驗證了其在柿芽變類型鑒定上具有不錯的分辨效果[15]。

本實驗利用SSAP分子標記對53份柿屬樣本進行了遺傳分析；通過UPGMA聚類,分析了供試樣本的遺傳多樣性,并在此基礎上探討了南方柿和北方柿兩大地理種群的關系,以期為柿品種的起源和進化研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試柿屬材料見表1。EcoR I和Mse I內切酶購自上海生工,引物由invitrogen公司(上海)合成。PCR反應中所用的其它試劑購自TRANSGEN公司。

表1 供試柿屬樣本植物

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 基因組總DNA的提取參考Luo， et al.[16]的方法。DNA質量及濃度檢測使用微量核酸儀,A260/A280比值在1.8左右,終濃度稀釋至50 ng/μL,于4 ℃保存備用。

1.2.2 基因組DNA的酶切、引物連接和PCR擴增 基因組DNA的酶切、引物連接和PCR預擴增和擴增參照Du[17]的方法,用于SSAP分析的接頭及引物序列見表2。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 6%聚丙烯酰胺變性膠經1600 V、80 W恒功率預電泳30 min后,點樣擴增終產物(變性)，再進行1600 V、65 W恒功率電泳約90 min,最后銀染顯色,用數碼相機拍照記錄電泳圖譜。

1.2.4 數據處理 將電泳圖譜中清晰的條帶按1(有)、0(無)進行記錄,通過NTSYS pc v2.10e軟件[18]進行聚類分析,得到UPGMA聚類圖。

2 結果與分析

2.1 電泳圖譜

PAGE電泳圖譜顯示擴增產物在100～1500 bp都有分布,清晰易辨識的條帶大多分布在300～1000 bp；圖1所示為引物LTR2R/EA02的擴增圖譜。

2.2 條帶的統計結果

12對引物一共統計有441條清晰條帶,其中多態性條帶440條,總體多態性百分率為99.77%,見表3。

表2 用于SSAP分析的接頭及引物序列

圖1 引物LTR2R/EA02擴增產物的電泳圖譜

2.3 遺傳多樣性聚類結果

全部53份柿屬樣本基于441條譜帶的UPGMA聚類圖見圖2。所有供試樣本的遺傳相似系數在0.54～0.96,在0.70處可將所有樣本劃分為兩大類群:柿種和柿屬近緣種(君遷子、美洲柿、老鴉柿、金棗柿、野生甜柿2號、油柿、浙江柿及野柿)。該聚類結果與韓振誠等[19]的研究結果相似。野柿作為柿的變種與柿種的親緣關系最近,這與張青林等[20]和鄧立寶等[21]的研究結果一致。

柿種類群在聚類圖上又可劃分出4個亞組:第①亞組主要包含羅田甜柿、四方甜柿、小果甜柿和與之親緣關系相近的湖北柿品種資源;第②亞組除去少數幾個品種外,多以北方柿(河北和陜西)為主;第③亞組則是南北柿品種混雜;第④亞組以北方柿(陜西)為主。

‘90-1-10’產自湖北羅田,它與柿種第①亞組的聚類關系相隔較遠,這與其屬于不完全甜柿類型相吻合。在完全甜柿的起源和進化歷程(澀柿→甜柿)中,‘90-1-10’作為中間過渡類型,對中國原產完全甜柿的起源和進化研究具有重要意義。

圖2 53份柿屬品種的UPGMA聚類圖

表3 條帶統計分析結果

3 討論

3.1 品種遺傳差異與地理位置的相關性

有研究表明,通過遺傳聚類顯示出的品種遺傳差異性與地理起源有一定的關系,特別是不同國家原產柿品種的差異性[22-24]。在本實驗研究中,品種和地域間的相關性集中反映在柿種第①亞組,與羅田甜柿、四方甜柿、小果甜柿親緣關系相近的湖北柿品種資源相聚緊密,這也表明我國湖北大別山區域是完全甜柿的原產地,蘊藏豐富的變異資源。但其他亞組都存在不同程度的地理交錯。因此不能從該聚類圖上劃分出我國南方柿與北方柿的分界線。

3.2 親緣關系與柿砧木的親和性

君遷子是目前北方普遍采用的柿砧木(南方主要采用野柿及油柿),但在聚類圖上,君遷子與柿種的親緣關系最遠。當前全世界興起甜柿種植,君遷子與許多甜柿品種(尤其是富有系列)嫁接存在不親和性,嚴重影響甜柿的推廣。相關研究表明脫澀性狀或親緣關系對嫁接親和性有較大的影響[25]。小果甜柿作為完全甜柿類型,與甜柿品種的親緣關系非常近,在用作甜柿砧木的可靠性方面已有實踐和理論上的佐證[26]。

3.3 柿品種起源及進化與人工選擇的關系

柿品種的起源和進化與人工選擇密切相關[19],尤其是主要栽培品種明顯受到了人工選擇和商品化交流的影響。本實驗中栽培柿品種的遺傳多樣性趨于狹窄(總體相似系數在0.75以上,多數類群內的相似系數在0.80以上)。探討柿的起源和進化,除栽培品種外,還應從收集寶貴的野生資源和古樹資源方面開展研究。另外,開展胞質遺傳因子(葉綠體、線粒體DNA)方面的研究也對柿品種起源和進化研究具有重要意義。

3.4 柿品種資源多樣性的保護

現代農業的可持續性發展已使農作物品種資源保護上升到戰略高度,深入發掘和利用好品種資源是做強農業的基礎。我國作為柿的主要原產地,具有豐富的原產柿品種,將在柿的新品種發掘和新品種改造中起到決定性作用。