ETS2在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

汪軍 黃裕 孫強 魏舒迅 祝徐軍 王長明 李新星 徐健

結直腸癌是常見的消化系統腫瘤，近年來發病率呈不斷上升的趨勢，尤其在年齡超過50 歲的中老年人群中，結直腸癌更是高發惡性腫瘤，而且多數患者發現時已屬于中晚期［1］。目前，結直腸癌的治療仍以手術為主，輔以放化療，但有近40%的患者術后3 年內出現腫瘤的復發或轉移［2-3］。因此，尋找預測結直腸癌患者術后進展的潛在標記物、以及治療靶點儼然成為了重要的臨床科學問題。轉錄因子ETS2 全稱 E-twenty-six proto oncogene 2，位于染色體21q22.2，其蛋白含有469 個氨基酸，在分類上屬于ETS 轉錄因子家族的成員，其最早發現是在鳥骨髓成紅細胞增多癥中，致病病毒E26表達融合蛋白基因v-ets91，許多ETS 都被證實與癌癥有關。研究表明，ETS2 調控細胞的增殖和凋亡，導致腫瘤發生［5］。有學者在人類乳腺癌的樣本中發現ETS2 高水平表達，并且與腫瘤的淋巴結轉移密切相關［6］。在前列腺癌中，抑制ETS2 的表達能抑制腫瘤的生長和侵襲［7］。然而，目前對于ETS2 結直腸癌組織中的臨床意義尚不清楚，因此，本研究收集結直腸癌新鮮組織和石蠟切片，通過檢測ETS2 mRNA 和蛋白表達情況，探討ETS2在結直腸癌組織中的表達情況，分析其與結直腸癌患者臨床病理參數之間的關系，并評估其臨床預后價值。

資料與方法

一、標本收集

收集2017 年12 月至2018 年12 月期間在寶山區中西醫結合醫院接受手術根治的結直腸癌患者的癌組織、癌旁組織（距離癌組織邊緣2 cm～5 cm）和相應正常組織（距離癌組織邊緣5 cm 以上），液氮冷凍保存。另收集2011 年1 月至2013 年12 月 期間在長征醫院接受手術根治的結直腸癌患者癌組織、癌旁組織的石蠟標本。入選條件：所有病例均經病理確診屬于Ⅰ～Ⅲ期；均具有完整的臨床資料及病理資料；所有患者術前均未接受放、化療（包括腹腔灌注）。排除條件：合并其他多發腫瘤疾病史，或合并其他遺傳性疾病；因腫瘤復發或轉移而行2 次或以上手術；嚴重心血管疾病、或其他無法控制的合并疾病。

依上述標準選取病例，結直腸癌新鮮組織標本入組32 例，包括配對的癌旁組織、正常組織，其中男性18 例，女性14 例，年齡45～79 歲，平均年齡（58.9±4.5）歲。選取結直腸癌石蠟切片121 例，其中配對的癌旁組織切片46 例，男性87 例，女性34 例，年齡34～81 歲，平均年齡（60.4±2.8）歲。 對121 例接受根治手術的結直腸癌患者隨訪時間3～89 個月，末次隨訪時間2018 年6 月30 日，中位隨訪56 個月，完整隨訪89 例，失訪32 例，其中55 例患者出現進展（腫瘤復發或轉移），其中相關性分析納入121 例數據分析，生存分析納入有完整隨訪數據的89 例病例。

二、實驗方法

實時熒光定量PCR：Trizol RNA 抽提液提取新鮮組織的RNA，將1 μL Oligo dT 和2.0 μg Total RNA 加入到PCR 小管中，混勻后離心，70 ℃溫浴10 min，使Oligo dT 和模板退火，上述體系在PCR儀上完成逆轉錄反應，反應條件為37 ℃，15 min； 85 ℃，5 s。熒光實時定量PCR 的反應體系：10 μL反應體系，并加陰性對照；實時熒光定量PCR 的反應條件：95 ℃ 10 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s；40 個 循環。定量PCR 數據分析，分別檢測內參β-actin 和目的基因。ΔCt=目的基因Ct 值-β-actinCt 值，根據每組各個ΔCt 值分別求出每組的均數。兩組間目的基因表達的變化以ΔΔCt 表示（ΔΔCt=各腫瘤組ΔCt 均數-對照正常組ΔCt 均數）。設正常組為1，腫瘤組為2 的-ΔΔCt 次冪作圖。

免疫組化：石蠟標本5 μm 厚連續切片，切片脫蠟水化：將切片置于60 ℃烤箱中烘烤l 小時；放置100%的二甲苯中脫蠟30 min；再于100%～75%酒精中浸泡各5 min 梯度水化，以0.3%的H2O2孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，滴加一抗（鼠抗ETS2 抗體1：100，Abcam 公司），4 ℃冰箱孵育過夜。加生物素標記二抗（DAKO 公司），室溫孵育30 min，加辣根過氧化物標記的三抗，室溫孵育30 min，DAB 顯色。蘇木精復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS 代替一抗作陰性對照。

三、結果判定

有經驗的病理科醫師判定免疫組化結果，ETS2 以胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達, 以細胞染色強度和細胞陽性百分率得分之積判定，選擇 5 個高倍鏡視野計數細胞判斷：（1）著色強度：無染色記0 分，淺黃色計1 分，棕黃色計2 分，黃褐色計3 分。（2）對陽性細胞所占百分比進行評分 （0～100%）。上述2 項相乘，弱陽性（±）＜50%：中等陽性（2 ＋）：50%～100%，強陽性（3 ＋）：100%～300%。將弱陽性定義為低表達，中等陽性和強陽性為高表達。

四、統計學分析

數據均采用SPSS 19.0 軟件進行分析處理。采用Mann-Whitney U-test 分析mRNA 的相對表達量差異，運用χ2檢驗分析ETS2 的表達與結直腸癌患者臨床病理特征之間的關系，生存分析的比較用Kaplan-Meier 生存曲線，多因素分析采用COX 回歸分析法。以P ＜0.05 為差異有統計學意義，所有檢驗和P 值均為雙側。

結 果

一、ETS2 的mRNA 在臨床新鮮結直腸癌組織中的表達

在32 例新鮮結直腸癌組織中，ETS2 mRNA的相對表達量為（238±15.13），而癌旁組織、正常組織中的相對表達量分別為（4±2.21）和（3±1.39），結直腸癌組織中ETS2 mRNA 的表達明顯高于癌旁組織和正常組織（P ＜0.001），而癌旁組織和正常組織中的ETS2 mRNA 表達量差異無統計學意義（P ＞0.05）。在病理II～III 期的結直腸癌組織中，ETS2 mRNA 的相對表達量明顯高于病理Ⅰ期，差異具有統計學意義（243±22.21 vs. 2.00±1.53，P ＜0.001）。見圖1。

二、ETS2 蛋白在結直腸癌石蠟標本中的表達

免疫組化結果顯示，ETS2 的表達主要位于胞核，ETS2 在52.07%（63/121）結直腸癌中表達，而僅在13.04%（6/46）的癌旁組織中表達，兩者比較差異有統計學意義（P ＜0.05）。如圖2 所示，ETS2 蛋白在結直腸癌組織中高表達，而癌旁組織中的表達量呈現低表達或不表達（P ＜0.001）。

三、ETS2 蛋白與臨床病理參數之間的關系

圖1 ETS2 mRNA 的表達。1A：結直腸癌、癌旁和正常配對的新鮮組織。1B：病理分期Ⅰ期和Ⅱ～Ⅲ期結直腸癌新鮮組織

ETS2 表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移是否以及錯配修復（MMR）狀態有關（P ＜0.05），即分化程度越低、病理T 分期越晚、有淋巴轉移或MSS 狀態的結直腸癌組織中ETS2的表達高，而與年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤位置無關（P ＞0.05），上述結果提示，ETS2 可能與結直腸癌惡性程度密切相關，即ETS2 表達越高，惡性程度可能越高。

四、ETS2 是結直腸癌患者術后無進展生存的獨立預測因子

如表2 所示，腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、MMR 狀態和ETS2 表達與預后密切相關（P ＜0.05），浸潤深度越深和ETS2 高表達的結直腸癌患者預后更差（P ＜0.05）（圖3）。Cox多因素生存分析提示，ETS2 表達（HR：0.461，95%CI：0.271～0.683，P=0.003）和浸潤深度（HR：0.352，95%CI：0.113～0.769，P=0.015）是結直腸癌患者術后無進展生存的獨立預測因子。

討 論

圖2 ETS2 蛋白在結直腸癌、癌旁組織中的表達情況，其中藍色顆粒代表細胞核、不表達ETS2 蛋白，褐色顆粒代表細胞核表達ETS2 蛋白。2A：ETS2 蛋白在癌旁組織和癌組織中的表達（×100 倍）；2B：ETS2 蛋白在癌組織中低表達和高表達圖（×200 倍）

ETS 蛋白上有保守的螺旋-轉角-螺旋DNA結合區（ETS 結構域），能夠特異性識別并結合到DNA 富含嘌呤的GGA（A/T）區域（EBP 位點），調控基因的轉錄［8］。研究表明，ETS2 調控細胞的增殖和凋亡，進而涉及腫瘤發生［4］。ETS2 的許多靶基因都涉及細胞周期調控，如cyclin D1，Bcl-2，Bcl-XL。ETS2 可結合靶基因UCA1 參與調控細胞周期和增殖［8-9］。此外，ETS2 還能夠與染色質重組復合物SWI/SNF 相互作用，共同作用于乳腺癌易感基因BRCA1 的啟動子區。在食管癌的研究中也發現對EST2 的抑制能導致細胞停滯于 G0/G1 期［4，8，10］。EST2 對細胞周期的調控有可能是通過對多種細胞周期調控蛋白的抑制作用來實現的［11-13］。本研究發現，與正常組織相比，ETS2 在結直腸癌組織中的轉錄和翻譯水平均過表達。此外，ETS2 的表達與淋巴結轉移和腫瘤浸潤深度呈正相關。這表明，ETS2 與結直腸癌的進展密切相關，ETS2 介導的信號通路有可能是結直腸癌發病中新的發病機制。進一步通過對結腸癌組織中ETS2 作用機制的研究可揭示結腸癌發病新的分子機制，能為結腸癌的診斷提供新的標志物，并為未來靶向治療提供新的治療靶點［4］。

我們還發現，MMR 狀態與ETS2 表達相關，低表達ETS2 的癌組織中存在更多的微衛星不穩定（MSI），與DNA 修復功能正常（MMS）的患者相比，MMR 功能缺陷（dMMR）患者預后相對較好（見表2）。文獻報道，MSI 的患者中腫瘤具有復發率低、緩解期長、低轉移和存活率較高［14-15］。對于具有dMMR/MSI-H 的Ⅱ期患者，給予5-FU輔助化療非但不能帶來生存獲益，反而對患者不利。ASCO 年會研究報告，對于經目前所有標準治療均失敗、且為dMMR 的晚期結直腸癌患者，可給予抗PD-1 單抗Pembrolizumab（帕姆單抗）治療，NCCN 指南也推薦帕姆單抗和Nivolumab（納武單抗）用于MSI-H/dMMR 轉移性結直腸癌患者的末線治療［16-18］。研究者推測，dMMR 癌細胞相比于MMR 正常癌細胞，更易累積突變，產生大量異源抗原，可有效地被免疫T 細胞識別，達到更好的免疫治療效果［16，18］。而MMR 狀態和ETS2 的表達調控關系，值得我們進一步研究。

表1 ETS2 蛋白的表達與結直腸癌患者 病理臨床參數的關系

目前，對于結直腸癌術后復發轉移的監測主要還依賴于血清CEA、腹部增強CT/MRI、結腸鏡以及PET-CT 等手段，盡管ctDNA、DNA 甲基化以及外泌體等新的檢測手段在腫瘤復發轉移監測的研究上取得一定的成果，但因為缺乏多中心RCT 結果以及昂貴的費用等原因，也一直未普及于臨床［19-20］。 利用生物分子標志預測術后復發轉移為結直腸癌術后腫瘤監測提供新的方向。我們證實，ETS2 表達（HR：0.461，95%CI：0.271～0.683，P=0.003）是結直腸癌患者術后無進展生存的獨立預后因素。這提示，ETS2 可能是預測患者術后復發和進展的潛在標記物。類似的結果在髓樣白血病、乳腺癌中也得到證實［5-6］。這為ETS2 作為臨床上腫瘤復發、轉移的生物預測標志物提供理論依據。但仍需多中心、大樣本量的進一步的驗證，此外，若建立組織——外周血漿同步檢測效能，將ETS2 的血漿檢測動態化、標準化、簡易化，有助于早期追蹤術后的微小殘留病灶，將具有重要的臨床轉化價值。

表2 結直腸癌臨床病理參數的單因素 和多因素的無進展生存分析

圖3 Kaplan-Meier 生存曲線。ETS2 高表達的結直腸癌患者無病生存期更差

綜上所述，和癌旁組織相比，ETS2 在結直腸癌組織中的表達水平明顯升高，而且具有獨立的預后預測意義，這就使ETS2 可能成為重要的治療靶點和有效的術后預測復發轉移的生物標志物。