左右半結腸癌與Programmed Death-1 信號通路

夏金紅 顧晉

結腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在我國呈逐年上升的趨勢，且發病率和死亡率均排在惡性腫瘤的前三位［1-3］。在結腸癌治療領域，長久以來就存在一個爭議，那就是“左右半之爭”，左、右半結腸是不是同一種器官？左、右半結腸癌是不是同一種腫瘤？這些問題引起了廣大腸癌研究者的注意。其中研究者Bufill［4］于1990 年首次系統地從多個方面闡述了左、右半結腸癌的不同，并提出二者是不同疾病的概念，將結腸以脾曲為界分為左半結腸（left sided colon，LSC）包括脾曲、降結腸、乙狀結腸和直腸，也稱為遠端結腸；右半結腸（right sided colon，RSC）包括盲腸、升結腸、肝曲和橫結腸，也稱為近端結腸，并將原發于左、右半結腸的惡性腫瘤分別稱之為左半結腸癌（left sided colon cancer，LCC）與右半結腸癌（right sided colon cancer，RCC）［5］。

左、右半結腸癌在胚胎來源、解剖結構、生理功能、分子特征、致癌機制、臨床特征、治療療效、復發轉移模式、生存預后等方面均存在不同［6-7］，其中二者在預后和治療療效上的差異引起了我們的關注。有研究者收集17 461 例腸癌患者，并對其預后進行了統計分析，結果發現右半結腸癌患者無論是總體生存率（OS，RCC 67% vs LCC 71%； P ＜0.01）還是無病生存率（DFS，RCC 73% vs LCC 74%；P ＜0.01）均差于左半結腸癌患者［8］。在治療療效上，有研究表明接受FOLFOX 方案治療的Ⅲ期結腸癌患者中，左半結腸癌比右半結腸癌有更好的DFS（HR=0.82，P ＜0.001）［9］。此外，多個臨床試驗也證實結腸癌的原發部位是影響靶向治療療效的重要因素［10］，EGFR 單抗治療能明顯改善LCC 患者的無進展生存期及總生存時間［11-12］。正是基于此點，2017 年NCCN 指南進行了重要更新，僅對左半結腸癌的KRAS/NRAS 野生型患者推薦一線行化療聯合EGFR 單抗治療。

左、右半結腸癌在預后和治療療效上存在如此顯著的差異，尋找左、右半結腸癌的差異基因及相關信號通路，探索左、右半結腸癌預后相關的分子機制就成為了我們的研究目的。

材料與方法

一、TCGA 數據庫

本研究使用TCGA 數據庫中結腸癌RNAseq數據，選擇術前未經任何化療或免疫治療的結腸癌患者為研究對象。共269 例CRC 患者，其中右半結腸癌110 例，左半結腸癌159 例。該數據集具有患者的隨訪信息，腫瘤解剖位置等信息。

二、免疫組化病例納入及排除標準

病例納入標準：（1）全身檢查無多原發癌證據。（2）術前行纖維結腸鏡確診為結腸腺癌。（3）于我院行結腸癌切除手術。（4）術前未行未經任何化療或免疫治療。

病例排除標準：（1）既往有腫瘤病史者。 （2）患者合并自身免疫性疾病或正在應用免疫相關藥物者。（3）手術未完整切除原發腫瘤。（4）家 族性息肉病惡變、遺傳性非息肉性結直腸癌（HNPCC）。（5）有心、肺、腎等嚴重并發癥者。

本研究納入2003 年2 月至2016 年12 月間北京大學腫瘤醫院結直腸腫瘤外科收治的263 例結腸癌患者的臨床資料，其中男性141 例，女性122 例，男女比為1.13:1，年齡28～85歲，平均（59.65±0.82）歲。 見表1。

表1 263 例結直腸癌患者的臨床病理特征

續表

隨訪：所有患者均接受術后隨訪，術后2 年內每3 個月1 次，術后3～5 年每6 個月1 次。復查包括病史和體檢，B 超或腹部CT，胸部平片，血清CEA、CA19-9。每年復查一次纖維結腸鏡檢查。

三、患者資料和標本的采集

從病案室和統計室收集病例的臨床病理學資料和隨訪資料，從病理科收集病例的存檔石蠟標本及組織切片。本研究得到北京大學臨床腫瘤學院倫理委員會的批準。

四、數據分析

使用TCGA數據分析左右半結腸癌差異基因，并于REACTOME 信號通路數據庫（https://www.reactome.org/）進行通路富集分析，發現差異基因在PD1/PDL1 信號通路富集，并分析了PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結腸癌的表達情況。對三個基因進行了Kaplan-Meier 生存分析。

五、免疫組化

PD1/PDL1/PDL2 在結腸腫瘤組織中的蛋白表達采用免疫組化的方法進行測量。組織芯片（TMA）在70 ℃干燥5 分鐘，經過三次二甲苯脫蠟，每次15 分鐘，然后依次通過梯度酒精進行水化，每次 5 分鐘，再經過3%的過氧化氫甲醇溶液去除組織內的過氧化物，抗原修復采用pH6.0 的檸檬酸鹽溶液高壓15 分鐘，山羊血清室溫封閉40 分鐘，一抗PD1（LS-B540，LifeSpan BioSciences，USA），PDL1（ab58810，Abcam，USA），PDL2（HPA013411，Sigma，USA）分別按照推薦濃度在4 ℃過夜孵育，次日經過二抗室溫孵育，DAB 顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精及二甲苯脫水等步驟。最終獲得的芯片使用Leica Microsystems（Aperio versa 200）進行掃描，由兩位有經驗的病理科醫生獨立進行閱片。對PD-L1 和PD-L2，通過染色強度記錄檢測到的蛋白表達量，免疫反應細胞的百分比評分為：無染色組織為0，弱或中度染色到強染色＜25%為 1 級、25%～50%的細胞有強染色為2 級，50%以上的細胞有強染色記錄為 3 級。對于PD1，我們計算10 個互不重疊視野中的 PD1 ＋細胞總數，再計算每平方毫米內PD1 ＋細胞密度，以此作為PD1 蛋白表達量計量方法。

六、統計學分析

所有的統計分析都是采用SPSS 18.0 統計軟件（SPSS Inc，Chicago，IL）和GraphPad Prism 7.0。Mann-Whitney test 和t test 用于檢驗蛋白及基因在癌組織中的表達差異。總生存（OS）時間被定義為從手術之日到因任何原因死亡的時間，Log-rank test 用于Kaplan-Meier 生存分析。P ＜0.05 被認為差異具有統計學意義。

結 果

一、左、右半結腸癌差異基因與PD1 信號通路的數據分析

尋找左、右半結腸癌差異基因時，我們將TCGA 數據分為左半結腸癌組和右半結腸癌組，以差異表達倍數（fold change，FC）＞1.5 倍，P ＜0.01作為篩選差異表達基因的標準，共篩選出2 529 個基因，這批基因進行通路富集，根據P 值和FDR值排序，前10 條都與免疫系統相關，如PD1 信號通路，TCR 相關信號通路以及MHC 二類分子信號通路，見圖1。因此我們認為PD1 信號通路在左、右半結腸癌中差異顯著。PD1 信號通路中重要的基因主要有PDCD1，CD274，PDCD1L2，且這三個基因都屬于左、右半結腸癌差異基因。

二、PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結腸癌中表達差異的數據分析

首先我們利用TCGA 數據庫中CRC 的RNAseq 數 據，分 析PDCD1，CD274 及PDCD1L2 于RNA 水平上在左、右半腸癌中的表達差異，結果見圖2。由結果可看出，三個基因在右半結腸癌的表達都高于左半結腸癌（P ＜0.05）；分層分析結果顯示，盲腸和升結腸中表達量較高，脾曲和降結腸表達量較低。

圖1 2 529 個左、右半結腸癌差異基因reactome 通路分析

Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，這三個基因在整體結腸癌中的表達量與預后無關，但是我們將患者根據腫瘤位置以及基因表達量高低，分為右側高表達組，右側低表達組，左側高表達組，左側低表達組，進行Kaplan-Meier 預后分析，分析左、右半位置和表達量的關系，發現當PDCD1，CD274，PDCD1L2 基因高表達時，RCC 預后顯著差于LCC（OS，P ＜0.05），結果見圖3。

圖2 PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結腸癌中的表達差異。2A：PDCD1，CD274，PDCD1L2 在RCC 中表達高于LCC；2B：PDCD1，CD274，PDCD1L2 在各亞部位腸癌的表達

圖3 PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結腸癌中的生存分析。3A～3C：PDCD1，CD274，PDCD1L2在高表達時，才有RCC 預后差于LCC；3D：在整體CRC 患者中，RCC 預后差于LCC

三、PD1，PDL1 和PDL2 在左右半結腸癌中的蛋白表達差異

為了明確PD1，PDL1 和PDL2 在組織中的分布情況以及在左、右半結腸癌中的蛋白表達差異，我們收集263 例結腸癌患者臨床樣本進行免疫組化實驗，結果見圖4。結果顯示PD1 主要表達于腫瘤浸潤淋巴細胞，PDL1 和PDL2 主要表達于腫瘤細胞。蛋白表達與RNA 表達結果基本一致，PD1，PDL1 在右半中表達量高于左側（P ＜0.05），而PDL2在二者中的表達差異無統計學意義（P=0.054）。 Kaplan-Meier 生存分析顯示（圖5），只有PDL1的表達量影響患者的預后，即PDL1 的表達量越高預后越差（OS，P=0.0168），且在分層分析中右側PDL1 高表達組預后最差，而PD1 與PDL2 的表達量不影響患者的預后（OS，P ＞0.05）。

討 論

圖4 PD1，PDL1 在左、右半腸癌中的免疫組化結 果。4A：PD1 在左右半結腸癌中的表達免疫組化結果，在RCC 中的表達高于LCC，P=0.007；4B：PDL1 在左右半結腸癌中的表達免疫組化結果，在RCC 中的表達高于LCC，P=0.0044

圖5 PDL2 在左、右半結腸癌中的免疫組化結果及Kaplan-Meier 生存分析。5A：PDL2 在左、右半結腸癌中的免疫組化結果，P=0.054；5B：根據免疫組化結果，PD1，PDL1，PDL2 的Kaplan-Meier 生存分析結果

左、右半結腸癌在解剖病理、治療和預后方面的差異成為結腸癌研究領域的熱點問題，本文的分析也證實右半結腸癌的預后差于左半結腸癌。越來越多的研究者通過組學分析的手段發現了左、右半結腸癌之間存在不同的分子學特征［13］，更加證實了RCC 和LCC 是兩種不同疾病的定論，但是RCC 預后更差的機制仍沒有得到確切的定論。

本研究通過分析左、右半結腸癌差異基因和通路，發現差異基因主要富集于免疫相關通路，說明左、右半結腸癌的免疫狀態顯著不同。免疫狀態不一樣影響結腸癌的預后和療效，免疫功能活躍的腫瘤患者預后較好且遠處轉移率低［14］，免疫狀態差的腸癌患者對治療的反應率也比較低［15］，這提示左、右半結腸癌在預后及治療療效上的差異可能是由于免疫狀態差異導致的。

我們發現左、右半結腸癌預后差異與PD1 信號通路顯著相關，且該通路中三個主要基因（PDCD1， CD274 和PDCD1L2）在mRNA 水平上，RCC 中的表達都高于LCC。根據腫瘤解剖學位置分層分析， 盲腸和升結腸中表達量較高，脾曲和降結腸表達量較低。生存分析提示，這三個基因在CRC 整體中的表達量與CRC 總體預后無顯著相關，但是我們根據腫瘤位置和基因表達量將患者分為右側高表達組，右側低表達組，左側高表達組和左側低表達組再分析，發現當PDCD1，CD274，PDCD1L2 基因高表達時，RCC 預后均差于LCC 的趨勢才會出現。

我們通過免疫組化實驗觀察PD1，PDL1 和PDL2 在左、右半結腸癌中蛋白水平的表達與預后的關系。Kaplan-Meier 生存分析顯示，只有PDL1的表達量影響患者的預后，即PDL1 的表達量越高預后越差，而PD1 與PDL2 的表達量不影響患者的預后［16］。

在腫瘤微環境中，表達PD1 的T 細胞可與表達在腫瘤細胞表面的PDL1/PDL2 結合，從而抑制T 細胞的免疫功能。PD1（PDCD1，CD279）是一種跨膜蛋白受體，主要表達于T 細胞，B 細胞，單核細胞，自然殺傷性T 細胞和樹突狀細胞膜上［17］。PDL1（CD274） 和PDL2（PDCD1L2，CD273）是PD1 的下游信號通路受體，同樣也是跨膜蛋白，PDL1 表達于多種細胞表面，其中在多種腫瘤細胞（乳腺癌，卵巢癌，結直腸癌等）上高表達，而PDL2 表達量較低，多表達于巨噬細胞、樹突狀細胞和某些特定的B 細胞亞群等［18］。在腫瘤中，PD1/PDL1 信號通路能夠抑制T 淋巴細胞增殖，細胞因子的釋放，引起腫瘤相關性T 細胞的耗竭和凋亡，進而使得腫瘤細胞逃避機體免疫系統的攻 擊［19-20］。因此本研究提示，右半結腸癌預后差可能與PD1 信號通路在RCC 中激活有關。

目前PD1/PDL1 抗體治療用于多種晚期腫瘤的治療，且取得了明顯的效果［12］。但是對于晚期結腸癌患者，使用PD1/PDL1 抗體治療僅有少數患者取得明顯的療效［21］。本研究顯示左、右半結腸癌免疫狀態不同，PD1信號通路的活化狀態也不相同，可能影響左、右半結腸癌患者的預后及治療療效。因此對結腸癌以及PD1/PDL1 信號通路兩者之間的關系進行更細致的研究，有助于探索左、右半結腸癌差異及其與預后相關的機制，為患者治療前的選擇提供更好的指導。