大腸埃希菌中細胞分裂抑制子的潛在調控基因篩選

劉健平，魯洋，曾建明,陳茶

1 廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州510000；2 廣東省中醫院

1994年Fuque[1]首次提出群體感應系統(QS)的概念，打開了細菌間通信機制研究的大門，QS系統已成為微生物領域的研究熱點。QS概念描述了細菌通過感知特定信號分子濃度以監測環境中群體密度的變化，繼而進行細菌間特定的交流，當信號分子達到一定濃度閾值時，誘導菌體相關基因的表達來適應環境中的變化。在革蘭氏陰性菌中，細菌通過自身合成并分泌特定的信號分子N-酰基-L-高絲氨酸內酯(AHLs)與相應的受體蛋白結合后形成復合物，在特定的基因啟動子序列處結合DNA，然后激活或抑制靶基因轉錄。大腸埃希菌(E.coli)自身不合成AHLs，但含有AHLs受體細胞分裂抑制子(Sdi A)蛋白，可感應并應答其他細菌產生的群體信號分子。Sdi A蛋白最初僅被認為是細胞分裂抑制因子，可抑制細胞分裂，后來發現Sdi A蛋白是大腸埃希菌惟一明確的QS系統受體蛋白，具有轉錄調節功能，可調控自身多項生命活動[2]。目前研究[3～5]發現，大腸埃希菌群體感應系統可介導細菌的耐酸性、毒力、運動性、生物膜形成、耐藥性等多種生理過程。隨著新一代測序技術的發展和測序平臺建立的日趨完善，轉錄組測序可快速可靠地獲得物種在某一狀態下幾乎全部轉錄本及基因序列，再通過生物信息學工具抓取足夠的信息來對特定物種進行分析，以推測其調控規律[6]。本研究為繼續尋找Sdi A蛋白調控細菌生命活動的可能機制，通過聯合E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株經過有或無AHLs信號分子處理后收集菌液進行測序，通過生物信息學方法分析各菌株基因表達的差異情況，綜合分析Sdi A的潛在調控基因，為后續進一步揭示Sdi A蛋白的生物學功能及其調控生命活動的具體機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 菌株E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株由本實驗室保存，3-oxo-C12-HSL購自Sigma公司，C4-HSL購自Cayman公司，RNA提取試劑盒購自東盛公司。

1.2 菌株分組及處理 取E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株過夜菌液100 μL，分別接種到2支含3 mL新鮮LB液體培養基玻璃試管中，分別記為非AHLs處理組和AHLs處理組。AHLs處理組中加入AHLs信號分子3-oxo-C12-HSL與C4-HSL的混合液，使其終濃度為20 μmol/L；非AHLs處理組加入等量DMSO。

1.3 差異表達基因的篩選方法 三種菌株經37℃ 220 r/min震蕩培養4 h后收集菌液，用RNA抽提試劑盒提取細菌總RNA，置于-80℃保存，送廣州瑞科基因科技有限公司進行基因轉錄組測序。轉錄組測序的原始數據經trinity RNA-Seq(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq)處理，然后通過R語言edgeR軟件包篩選差異表達基因，篩選條件：︱log2FC︱>1.5且P<0.05。

1.4 Sdi A潛在調控基因的篩選 ①無AHLs信號分子時Sdi A的潛在調控基因篩選。選取非AHLs處理組組內E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現差異性表達的基因，即為無AHLs信號分子時Sdi A的潛在調控基因。②有AHLs信號分子時Sdi A的潛在調控基因篩選。選取AHLs處理組組內E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現差異性表達的基因，即為有AHLs信號分子時Sdi A的潛在調控基因。③兩組Sdi A潛在調控基因比對。比對無AHLs信號分子時Sdi A的潛在調控基因、有AHLs信號分子時Sdi A的潛在調控基因，觀察有、無AHLs信號分子時Sdi A潛在調控基因的變化。

2 結果

2.1 無AHLs信號分子時Sdi A潛在調控基因的篩選結果 非AHLs處理組中，與E.coliSM10λpir野生株相比，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株有14個基因出現差異性表達，其中8個基因表達上調，包括narH、narJ、narI、yeeE、cysW、iraD、yfaP、narG基因，6個基因表達下調，包括mhpE、paaE、yiaN、yeeS、yeeR、flu基因；與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株比較，E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株有108個基因出現差異性表達，其中64個基因表達上調，包括nanC、nanM、nanS、yjhB、lacY、ssnA、flu、ygeW、nanT、dmlA、nanE、lacZ、ygfK、nanA、mglA、nanK、dctA、hycF、hdhA、sdhC、ygeY、ygeX、dsdX、yjhC、ygfM、hyaB、mglB、hycE、ydcI、hycG、cstA、xdhA、flgA、galS、dadA、yhcH、xdhD、hyaF、hyaA、uacT、sdhA、msrB、xdhB、xdhC、allC、allD、paaE、emrY、yjfN、sgrS、glpF、ydeN、melA、yeeR、hycH、yjiY、tdcB、glsA、uspC、fadH、hyaD、dsdA、hycD、hyuA基因，44個基因表達下調，包括nikD、endA、opgC、yjbI、nikR、sodA、yfcC、narK、guaB、aqpZ、nikC、nirB、yqeI、pyrD、nrfD、ybjE、nikA、yccM、nrfC、nrfE、yqeJ、wcaL、phoE、narH、hmp、rzpR、nrfF、mntP、nikB、narJ、ptsG、wcaG、dhaM、ycaK、ygbA、yhjX、narI、dhaL、hsdS、dhaK、ytfE、yeeE、hcr、hcp基因。由上可知，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現差異性表達的基因為narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、paaE、flu。其中，Sdi A基因敲除時，narH、narJ、narI、yeeE基因表達上調，yeeR、paaE、flu基因表達下調；而在Sdi A回復過表達后，上述基因表達趨勢相反，即narH、narJ、narI、yeeE基因表達下調，yeeR、paaE、flu基因表達上調，提示無AHLs信號分子時上述基因受到Sdi A的潛在調控。

2.2 有AHLs信號分子時Sdi A潛在調控基因的篩選結果 AHLs處理組中，與E.coliSM10λpir野生株相比，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株有18個基因出現差異性表達，其中13個基因表達上調，包括hcp、ytfE、hcr、narI、fimI、fimF、fimC、narH、narJ、narG、fimD、hmp、fimA基因，5個基因表達下調，包括ydiV、gadW、hdhA、yeeR、flu；與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株比較，E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株有91個基因出現差異性表達，其中55個基因表達上調，包括nanC、nanM、nanS、yjhB、lacY、flu、nanT、lacZ、nanE、hdhA、nanA、gadW、yhcH、dmlA、nanK、uacT、sdhC、mglB、ygeW、yjhC、ydiV、ygfK、sdhD、dadA、mglA、dctA、xylF、ssnA、ygeY、cstA、yciE、ygeX、ygfT、acrE、dgoA、sdhA、msrB、sdhB、yeeR、eutT、ynaJ、ybiA、mglC、ybcL、fliM、xdhA、allD、yjfJ、dsdX、xdhD、ygfM、fliF、hofN、galS、gltJ基因，36個基因表達下調，包括phoE、hypA、rpmE、nikB、mntP、purL、cvpA、ydiY、nikC、xanP、nrfD、nrfA、nrfC、narK、nrfG、ptsG、nrfB、purE、nikA、ygbA、nrfE、yccM、narH、wcaG、nrfF、narI、narJ、nirB、dhaL、hsdS、hmp、dhaK、dhaM、hcr、ytfE、hcp基因。由上可知，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達回復株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現差異性表達的基因為hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu、ydiV、hdhA。其中，Sdi A基因敲除時，hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE基因表達上調，yeeR、flu、ydiV、hdhA基因表達下調；而在Sdi A回復過表達后，上述基因表達趨勢相反，即hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE基因表達下調，yeeR、flu、ydiV、hdhA基因表達上調，提示有AHLs信號分子時上述基因受到Sdi A的潛在調控。

2.3 兩組菌株中Sdi A潛在調控基因比對結果 narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu基因在兩組菌株中均為Sdi A的潛在調控基因，hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因僅在AHLs信號分子存在時為Sdi A的潛在調控基因。

3 討論

Sdi A作為重要的轉錄因子和大腸埃希菌中目前惟一明確的QS系統受體蛋白，參與細菌的多項生命活動，受到研究人員的強烈關注[7]。然而，盡管有關Sdi A的研究報道眾多，但由于研究模型和研究方法的差異，得到的結論不盡相同。近年來，隨著測序手段的成熟和各式分析工具的應用，從測序結果中抓取重要的生物信息已被認為十分可信，在微生物種群鑒定領域中已廣泛應用。本研究通過敲除及過表達回復E.coliSM10λpir的Sdi A基因，在有或無AHLs信號分子時，利用RNA-seq測序技術獲得樣本轉錄組信息，篩選其中差異表達基因進行分析，使得我們獲取的信息具有全面性，又保證了結果的可靠性。通過比對AHLs處理組與非AHLs處理組中Sdi A潛在調控基因發現，無論是否有AHLs信號分子存在，narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu基因的表達均受到Sdi A基因的調控，提示Sdi A潛在調控上述基因，且此調控不依賴AHLs信號分子。此外，hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因僅在AHLs信號分子存在時出現表達變化，提示Sdi A對這幾個基因的調控依賴于AHLs信號分子的存在。

在大腸埃希菌中，narH、narG、narJ、narI基因編碼的硝酸還原酶復合體NarGHI是一種異三聚體復合鐵硫[Fe-S]鉬酸酶，包括含催化亞基的鉬輔因子(NarG)、含電子轉移亞基的[Fe-S]簇(NarH)和含血紅素的膜錨亞基(NarI)，它可在周質的Q-位點氧化萘醌或泛醌，在細胞質的鉬輔因子(雙鉬酸鹽鳥嘌呤二核苷酸，Mo-bisMGD)中還原硝酸鹽[8]。目前NarGHI復合體的研究報道甚少，其具體機制仍處于摸索階段。有報道[9]稱，NarGHI復合體可受環境因素的影響，但具體機制尚未明確。而作為QS系統的受體分子，Sdi A亦與環境因素密切相關，因此，NarGHI復合體受到Sdi A的調控不無道理。結合本研究測序結果，NarGHI復合體家族基因均受Sdi A的潛在調控，是Sdi A參與細菌硝酸鹽代謝有力證據。鑒于目前未有Sdi A參與調控NarGHI復合體或調控硝酸鹽代謝相關的研究報道，因此，進一步深入研究二者的調控關系意義重大。另一方面，當加入AHLs后，另一與硝酸鹽還原有關的基因hcp、hcr亦受到明顯影響，進一步說明Sdi A與硝酸鹽代謝有密切關系。hcp、hcr基因受同一個操縱子調控，hcp編碼一種高親和力一氧化氮(NO)還原酶，是厭氧條件下將NO變成N2O的主要酶，hcr編碼一種NADH依賴的還原酶。研究[10]顯示，hcr保護hcp不被NO滅活，兩者聯合表達，保護多種細菌免受亞硝酸鹽的脅迫。hcp缺失將會導致細菌生長期間對NO極為敏感。研究[11]顯示，在厭氧環境中膜相關硝酸還原酶NarG表達上升，細菌還原亞硝酸鹽生成副產物NO增多，細菌為保護自身免受NO脅迫，上調表達hcp、hcr基因。大腸埃希菌黃血球蛋白(Hmp)是目前已知的NO解毒蛋白，具有很強的雙加氧酶活性，以氧為底物將NO轉化為硝酸根離子。通過轉錄調節hmp基因表達合成Hmp是對NO及相關硝態氮脅迫的一種適應性反應，因此hmp是大腸埃希菌一種重要的保護機制，并且可能有助于腸致病性大腸埃希菌在腸道炎癥反應期間的存活時間[12]。hcp與hmp同為硝酸鹽代謝相關基因，兩者存在一定的協同關系。近期研究[13]顯示，ytfE編碼YtfE蛋白，可作為鐵供體，參與修復被氧化和亞硝化條件破壞的含鐵硫酶活性所必需的蛋白質，該基因的表達在AHLs的刺激下受到Sdi A的調控，可能與上述硝酸還原酶復合體NarGHI的表達變化有關。綜上所述，在本次測序結果中，NarGHI復合體基因、hcp、hcr、hmp、ytfE基因均受到Sdi A的潛在調控，多個靶基因指向Sdi A參與細菌硝酸鹽的代謝，在Sdi A缺失時，上述基因表達增強，提示Sdi A可能抑制上述基因的表達。人類體內大腸埃希菌天然定植于腸道中，在這一厭氧環境下，大腸埃希菌可能通過調節Sdi A的表達量繼而調控自身硝酸鹽代謝，但具體機制還需進一步研究。

flu基因又名為Ag43基因，編碼Ag43蛋白，是大腸埃希菌中一種重要的外膜自轉運體黏附蛋白。該蛋白受體不僅存在于人類靶細胞上，而且存在于細菌的表面，導致細菌相互黏附，并通過細菌自身聚集形成微菌落[14]。flu基因的缺失會干擾生物膜的形成[15]，其表達受到甲基化酶脫氧腺苷-DNA-甲基轉移酶(Dam)和氧化應激調節子OxyR的調控，OxyR作為flu基因表達的阻遏子，與Dam競爭結合flu啟動子區域實現flu的抑制或表達[16]。研究[17,18]推斷環境信號可能影響Dam與OxyR的競爭結果，但目前具體的環境因素或調節子尚未明確。近期研究報道，Sdi A也是影響大腸埃希菌生物膜形成的重要分子，但flu是否介導Sdi A調控生物膜形成的研究尚未見報道，且Sdi A在調控flu表達過程中是否與Dam、OxyR具有協同或拮抗作用同樣有待進一步探討。另一方面，yeeR、yeeE基因為同一個家族成員，是細胞膜的組成部分，yeeR與flu由同一個操縱子操控，在本次測序結果中共同受Sdi A的正向調控，而yeeE則呈反向調控，提示上述基因表達改變可能是影響細菌生物膜形成的又一因素。

大腸埃希菌中，ydiV基因編碼抗FLhD4C2因子，該因子在鞭毛基因表達水平上充當營養條件的調節劑。研究[19]表明，在低營養條件下，通過多重質粒過表達ydiV時，會減少鞭毛的產生和抑制大腸埃希菌的運動性。ydiV基因在加入AHLs信號分子后出現差異性表達，正符合Sdi A通過感知環境調節自身基因表達的模式。雖然QS系統調控鞭毛的合成早有報道，但ydiV基因受QS系統調控卻是由本研究首次提出。

paaE基因編碼PaaE，是苯乙酰加單氧化酶A復合體(PA-CoA)的部分亞基。PaaE亞單位是一種選擇性NADPH和FAD的還原酶，其雙鐵中心可直接進行電子轉移，還原細胞色素C，催化芳香環的氧化[20]。大腸埃希菌利用PA-CoA復合體來代謝苯乙酸(PA)。PA是一種環境污染物，大腸埃希菌可代謝PA進而獲得碳源。根據測序結果，paaE的表達量與Sdi A的表達量呈正相關，可能是細菌感知環境PA聚積后作出的一系列反應。

hdhA基因編碼7α-羥基甾體脫氫酶，其底物主要是酒精、葡萄糖、15-羥基前列腺素和羥類固醇等[21]。大腸埃希菌中，該酶可轉化膽汁，繼而獲得能量，但由于其研究甚少，具體的功能尚未被詳細報道。有研究[22]指出，在有氧條件下，環境滲透脅迫可誘導hdhA基因在轉錄水平上的表達增高。Sdi A作為環境的感受器，同時是轉錄調節子，在AHLs信號分子刺激下，參與hdhA基因的調控不無道理。

綜上所述，大腸埃希菌中Sdi A的潛在調控基因有narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu、paaE、hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA，其中對hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因的調控依賴于AHLs信號分子，為下一步揭示Sdi A新的生物學功能打下了堅實的基礎。