腦膠質瘤組織中差異表達基因的生物信息學分析及腫瘤發生發展關鍵調控基因篩選

鄭詩豪，陳忠儀，黃紹崧，劉宇清，黃繩躍

福建省立醫院，福州350001

腦膠質瘤是顱內最常見的原發性高度惡性腫瘤，約占所有神經腫瘤的30%，惡性腦腫瘤的80%[1]。根據2016年世界衛生組織(WHO)的指南，結合組織病理學和最新的分子生物學特征，腦膠質瘤可劃分為Ⅰ～Ⅳ級。腦膠質瘤的治療方法主要包括手術切除、術后輔助放療和化療，但腦膠質瘤的臨床治療效果仍不能令人滿意[2]。研究[3]顯示，惡性程度最高的膠質母細胞瘤患者中位生存期只有14個月。雖然與膠質瘤母細胞瘤相比，低級別腦膠質瘤表現出較為良性的生物學特性與較好的預后，但仍存在相當高的復發率，并且隨著時間的推移，其惡性程度與WHO分級也相應增加[4]。腦膠質瘤的發病機制涉及多個因素和步驟，包括遺傳和表觀遺傳改變，盡管多種腦膠質瘤的致癌機制已被證實，如p53和受體酪氨酸激酶信號通路等[5]，但我們對腦膠質瘤發生發展的確切機制仍知之甚少，因此與腦膠質瘤發生發展相關的重要分子標志物仍需進一步探尋。本研究基于基因公共表達數據庫(GEO數據庫)，通過篩選出腦膠質瘤組織與正常腦組織之間的差異表達基因，采用生物信息學方法對差異表達基因進行GO功能富集、KEGG信號通路分析、關鍵調控基因篩選，為深入研究腦膠質瘤的發生發展提供新的基因靶點。

1 資料與方法

1.1 腦膠質瘤組織與正常腦組織基因表達譜數據的選擇與獲取 從GEO數據庫中選擇并下載編號為GSE2223的腦膠質瘤表達譜芯片，該芯片基于GPL1833平臺SHFK檢測，由49例腦膠質瘤以及4例人類正常腦組織樣本組成，提取該芯片中腦膠質瘤組織與正常腦組織的基因表達譜數據用于后續數據分析。49例腦膠質瘤中包含31例膠質母細胞瘤、2例毛細胞星形細胞瘤、1例低級別星形細胞瘤、1例間變型星形細胞瘤、8例少突膠質細胞瘤、6例間變型少突星形細胞瘤。

1.2 腦膠質瘤組織與正常腦組織差異表達基因的提取與篩選 利用R語言將芯片中腦膠質瘤組織與正常腦組織的基因表達譜數據的表達強度歸一化，使得表達強度在一組陣列上具有相似的分布。利用R語言limma包，設置篩選條件為差異倍數>4倍且P<0.05(logFoldChange>2&adjustP<0.05)，篩選出芯片中腦膠質瘤組織與正常腦組織的差異表達基因。

1.3 差異表達基因的基因本體(GO)功能富集和KEGG信號通路分析 使用R語言的org.Hs.eg.db包對篩選出的差異表達基因進行GO功能富集，包括差異表達基因參與的生物學過程、細胞組分以及分子功能三個層面，取P<0.05且P值最顯著的前10個結果。利用DAVID 6.8在線分析網站對篩選出的差異表達基因參與的KEGG信號通路分析，下載分析結果后應用R語言ggplot2包按照P<0.05條件篩選出排名前10的信號通路。

1.4 腦膠質瘤發生發展關鍵調控基因的篩選 將篩選出的腦膠質瘤組織與正常腦組織差異表達基因導入STRING網站，構建差異表達基因編碼的蛋白間相互作用(PPI)網絡圖，設置篩選標準為蛋白間相互作用得分(interactionscore)>0.4，剔除無相互作用的孤立蛋白，整理成最后的PPI網絡圖并進行可視化處理，根據蛋白間臨近相互作用對計數，選取前20個差異表達基因，即為可能參與腦膠質瘤發生發展的關鍵調控基因。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織與正常腦組織差異表達基因篩選結果 共篩選出107個差異表達基因，與正常腦組織相比，腦膠質瘤組織中上調的基因48個、下調的基因59個。上調的基因為PRRX1、GPR34、NES、TSKU、EHD4、CXCL16、ABCA1、NID1、PXDN、MTHFD2、SLCO2B1、LST1、TYROBP、VSIG4、TIMP4、ZNRD1-AS1、MST1L、S1PR3、MB、LILRB4、ITGA7、BBOX1、MAFB、RUNX1、CRISPLD1、SLAMF8、UHRF1、TCEB3、GATSL3、ID3、MS4A4A、MS4A6A、COL4A2、PLEK、CDKN1A、ITGA5、MS4A6E、SRGN、CCL11、KCNMB1、UBE2C、CLEC5A、IFI44L、TNFRSF12A、SOX4、SPOCD1、IL33、CLCF1。下調的基因為HPCAL1、PNMAL2、PDE1B、MAL2、CAMK2A、CAP2、RAB3B、PHOX2B、PAK1、TMEM155、CAMK2B、ITPR1、MRAP2、RGS4、SNCG、CYP26A1、BCL11A、LINGO2、GABRA1、NUCB1、NRIP3、MAP7D2、HS6ST3、SNCA、KCNAB2、RAB27B、GDA、CAMKV、STXBP5L、RBFOX1、STXBP1、SULT4A1、RAB3A、VSTM2A、HPCAL4、CDK5R2、SOWAHA、CLEC2L、RYR2、FGF13、OSTM1-AS1、NAPB、SYP、FBXL16、L1CAM、MAST3、MARCKSL1、NEFL、CPLX2、PITPNM3、PHYHIP、INA、NRGN、TF、UBE2QL1、WBSCR17、LGI3、CACNG2、GAD2。

2.2 差異表達基因的GO功能富集和KEGG信號通路分析結果 GO功能富集結果顯示，差異表達基因在細胞組分上的改變主要表現在運輸囊泡膜、神經遠端軸突、神經軸突、突觸囊泡、突觸囊泡膜、運輸囊泡膜等結構上，分子功能變化主要集中在突觸融合蛋白、鈣調蛋白、磷脂酶結合蛋白、肌凝蛋白及突觸后的結構等功能上；生物學過程體現在神經遞質分泌、運輸及釋放、突觸囊泡周期的調節、神經突觸跨突觸信號傳導等生物學過程上。KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因與腫瘤蛋白聚糖通路、催產素信號通路、胰島素分泌通路、鈣信號通路、HIF-1信號通路、ErbB信號通路等有關。

2.3 腦膠質瘤發生發展關鍵調控基因的篩選結果 構建的PPI網絡圖由136個節點、75個蛋白相互作用構成,PPI網絡圖中蛋白間相互作用對數前20的差異表達基因分別為CAMK2A、CPLX2、SYP、RAB3A、GABRA1、TYROBP、CAMK2B、NEFL、STXBP1、VSIG4、GAD2、RBFOX1、HPCAL4、NRGN、PNMAL2、CDK5R2、LGI3、ABCA1、COL4A2，ITPR1，可能為參與腦膠質瘤發生發展的關鍵調控基因。

3 討論

本研究挑選GEO數據庫中編號為GSE2223的表達譜芯片，芯片數據由49例腦膠質瘤腫瘤組織樣本、4例腦組織樣本組成，共篩選出107個差異表達基因，這些基因都可能與腦膠質瘤的發生發展相關，進一步進行GO功能富集和KEGG信號通路分析。GO功能富集結果顯示，腦膠質瘤在細胞組分上的改變主要表現在神經突觸、神經軸突、突觸囊泡、突觸囊泡膜、運輸囊泡膜上，分子功能變化主要集中在突觸融合蛋白、鈣調蛋白、磷脂酶、肌凝蛋白及突觸后的結構上，生物學過程體現在神經遞質分泌、運輸、傳遞以及神經信號傳導等變化。本研究中，GO功能富集結果的三個層面都一致提示腦膠質瘤的進展與神經元活動相關。在正常的腦組織中，神經活動誘導神經膠質干細胞和祖細胞的增殖，并通過谷氨酸酰能的突觸引導他們的遷移[6,7]。Venkatesh和Venkataramani等[8,9]兩篇研究報告表明，腦膠質瘤細胞上的神經元過度興奮可刺激谷氨酸酰能突觸，進而激活腫瘤細胞間鈣信號網絡，促進多級細胞致癌信號級聯和細胞骨架重塑，從而促進腦膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力。Venkatesh等[10]認為，神經元活動在腦膠質瘤的增殖過程中起著重要作用，進一步研究發現突觸黏附分子神經膠質素3可通過PI3K-mTOR通路促進腦膠質瘤的增殖。目前神經活動與腦膠質瘤相關的研究仍鮮有報道，因此神經元活動在腦膠質瘤中所起的作用值得進一步探討和發現。

KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因參與介導了癌癥中蛋白聚糖通路、催產素信號通路、胰島素分泌通路、鈣信號通路、HIF-1信號通路、ErbB信號通路等多條信號通路。在癌癥中，蛋白聚糖可驅動腫瘤細胞中的多種致癌途徑，并在腫瘤微環境中起著重要作用。Wade等[11]提出蛋白聚糖激活了腫瘤細胞受體酪氨酸激酶信號通路，從而促進膠質母細胞瘤的發生發展。越來越多的證據[12]也表明，鈣可能是腦膠質瘤中發生發展的重要正向調節因子，其作用涉及腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡等功能。

本研究通過PPI網絡圖進一步篩選出影響腦膠質瘤發生發展的前20個關鍵調控基因，其中部分基因已在腦膠質瘤中有相關研究報道，如RAB3A基因，它與正常大腦突觸囊泡的運輸有關。KIM等[13]研究發現，RAB3A基因可促進腦膠質瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，并可促進維持干性。WANG等[14]研究證實，miR-25和miR-183可靶向調控NEFL基因促進膠質母細胞瘤的增殖。VSIG4基因已被發現可誘導腦膠質瘤細胞發生上皮-間質轉化，并促進細胞的侵襲和遷移，并且在腦膠質瘤患者中發現高表達VSIG4患者的預后不良。但本次篩選出的大部分關鍵調控基因目前在腦膠質瘤中的研究較少，值得我們進一步探究。

目前關于腦膠質瘤發生發展的分子生物學研究成果正在逐漸應用于臨床。2016年，WHO在腦膠質瘤組織分型的基礎上增加了分子分型的分類，有力推動了腦膠質瘤的精準診斷和治療的進程。但是腦膠質瘤發生發展主要機制仍不明確，因此仍需在基因層面深入探尋腦膠質瘤發病的機理。本研究基于GEO數據庫中GSE2223芯片數據深入挖掘腦膠質瘤的差異表達基因，通過GO功能富集和KEGG通路分析預測了其可能的發病機制，并構建了差異表達基因的PPI網絡圖，篩選了可能參與腦膠質瘤發生發展的關鍵調控基因，初步揭示了腦膠質瘤發生發展相關的靶點、信號通路，為今后的基礎研究與臨床診治提供了新的思路和方向。