NIN1結合蛋白1激活人Src原癌基因調控前列腺癌細胞生物學特性的研究

房 曉 王 健 張向明 鮑 一 王軍凱

前列腺癌是男性生殖系統最常見的惡性腫瘤，據報道其發病率僅次于肺癌，居男性癌癥病死率的第2位，近年來前列腺癌的發病率呈逐年增高趨勢。早中期前列腺癌患者預后較好，5年生存率可達到95%以上，中晚期前列腺、轉移性前列腺癌患者的臨床預后最差，5年生存率不超過30%[1]，故前列腺癌的早期診斷格外重要。需要尋找新型有效的診斷前列腺癌和判斷其預后的生物學標志物，可預防無癥狀前列腺癌的過度治療，以及確保惡性進行性腫瘤在早期檢測階段能得到及時治療。

NIN1結合蛋白1(NOB1)由NOB1基因編碼，是26S蛋白酶體一個亞基,在蛋白降解途徑中發揮關鍵作用。NOB1蛋白包括1個PIN區域和1個碳端鋅帶域，具有轉錄調控因子的作用。多數研究報道，NOB1在腎癌、結直腸癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、口腔鱗狀細胞癌等腫瘤組織中高表達[2-7]；NOB1可能參與多種腫瘤的發生，也可能是致癌因素[8-10]。本研究團隊的前期研究[11]中，通過Western印跡法和免疫組織化學技術證實NOB1在前列腺癌組織中高表達；預后分析、繪制生存曲線等統計學分析結果顯示,高表達NOB1的前列腺癌患者預后較差，表明NOB1在前列腺癌的發生和發展過程中起作用，可能是潛在的癌基因。目前，NOB1對前列腺癌生物學特性的影響及其作用機制尚未明確。本研究通過構建NOB1敲低的前列腺癌細胞系，觀察前列腺癌細胞的增殖、周期和侵襲能力，初步探討NOB1對前列腺癌細胞生物學特性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 前列腺癌細胞PC-3、DU145、22RV1和LNCaP均購自中科院上海細胞庫，細胞培養液RPMI-1640培養基購自美國Corning公司，FBS購自美國Invitrogen公司，1%青霉素、1%鏈霉素試劑購自上海博光生物公司，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自美國ApexBio公司。實時定量PCR所用反轉錄酶、SYBR酶購自日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程公司合成。NOB1、β-actin、人Src原癌基因(c-Src)、c-Src磷酸化(p-c-Src)抗體購自美國Abcam公司。MTT購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將常見的前列腺癌細胞22RV1、PC-3、LNCaP和DU145培養于含10% FBS、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640培養液中，在37 ℃、體積分數為0.05 CO2孵育箱中培養，每2 d更換1次培養基，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 慢病毒轉染和篩選 轉染慢病毒由上海漢恒生物公司提供，包括對照組病毒(Lv-shCtr1)和NOB1干擾病毒(Lv-shNOB1)。將細胞接種于6孔板內，待其貼壁后，換液為基礎培養基，根據感染復數計算的量,分別加入適量空白對照慢病毒(Lv-shCtrl,陰性對照組)和NOB1干擾慢病毒(Lv-shNOB1，敲低組)，混勻后置入37 ℃恒溫孵箱培養48 h。

1.2.3 實時定量PCR檢測 采用TRIzol法提取細胞總RNA，PC-3、DU145、22RV1、LNCaP 4種細胞取等量RNA按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得互補DNA。反應條件：預變性95 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s并采集熒光信號，進行40個循環。實驗重復3次。所用引物序列：NOB1正向引物5’-GAC ATA GGA GCC GGC GCA A-3’，反向引物5’-CGT ATT CCG GTA AGG GCT CC-3’。同法檢測PC-3和DU145細胞空白對照組(不轉染病毒)、陰性對照組、敲低組中NOB1的表達量。

1.2.4 Western印跡雜交 于放射免疫沉淀測定裂解液(RIPA裂解液)中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，置于冰上裂解細胞30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min。采用二辛可寧酸(BCA)法測定蛋白質濃度，取等量總蛋白與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液混合，100 ℃變性10 min。SDS-PAGE電泳，轉膜至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次,在4 ℃搖床上孵育一抗過夜。PBST洗膜3次，將相應二抗于室溫孵育2 h，應用Odessey紅外熒光掃描成像系統檢測蛋白質熒光強度。

1.2.5 MTT法檢測敲低NOB1后前列腺癌細胞PC-3、DU145的增殖活性 采用MTT法檢測敲低NOB1對前列腺癌PC-3和DU145細胞生成的影響。取對數生長期的細胞，經胰蛋白酶消化后于含血清的完全培養基中終止消化，以1 500×g離心3 min，去上清液，制成細胞懸液。細胞計數后，在96孔板中分為空白對照組、陰性對照組、敲低組3組，分別培養5 d，每天設置5個復孔。每天采用MTT法檢測細胞活性：加入MTT母液，反應2 h后，加入MTT B液終止反應，應用酶標儀檢測波長為595 nm 處的吸光度(A595)值。

1.2.6 流式細胞儀檢測敲低NOB1后前列腺癌細胞PC-3、DU145的細胞周期 將3組細胞用不含EDTA的胰酶消化后收集，冰冷PBS清洗2次，預冷70%乙醇固定，于4 ℃過夜；離心去除乙醇，PBS清洗3次，碘化丙啶(PI)染色，應用流式細胞儀檢測各組細胞DNA含量，并計算細胞周期。

1.2.7 Transwell實驗檢測敲低NOB1后前列腺癌細胞PC-3、DU145細胞的侵襲能力 取上述3組細胞，使用無血清培養基在預先鋪有基質膠的Transwell小室的上室中培養，下室中加入含10% FBS的RPMI-1640培養液，置于培養箱中培養24 h，0.5%結晶紫染色，于倒置顯微鏡下隨機選取6個視野攝片、計數，計算每個視野中的細胞平均數。

2 結 果

2.1 4種常見的前列腺癌細胞中NOB1的表達量比較 惡性程度較高的前列腺癌細胞22RV1、PC-3、DU145的NOB1 mRNA相對表達量分別為1.000±0.157、1.576±0.150、2.404±0.513，均顯著高于惡性程度較低的前列腺癌細胞LNCaP的0.559±0.081 (P值均<0.05)。Western印跡法檢測前列腺癌細胞22RV1、PC-3、LNCaP、DU145的NOB1蛋白質相對表達量分別為1.00±0.00、3.39±1.05、0.33±0.07、1.89±0.34，22RV1、PC-3、DU145細胞的NOB1蛋白質相對表達量均顯著低于LNCaP細胞(P值均<0.05)。見圖1。

1 22RV1細胞 2 PC-3細胞 3 LNCaP細胞 4 DU145細胞

2.2 慢病毒轉染PC-3和DU145并驗證敲低效率 為進一步研究NOB1基因在前列腺癌細胞中的生物學功能，本實驗選擇NOB1表達量較高的前列腺癌細胞PC-3和DU145構建NOB1基因的shRNA的干擾載體。PC-3細胞的空白對照組、陰性對照組和敲低組的NOB1 mRNA相對表達量分別為1.000±0.178、0.864±0.065、0.489±0.074，敲低組顯著低于空白對照組和陰性對照組(P值均<0.05)；DU145細胞的空白對照組、陰性對照組和敲低組NOB1 mRNA相對表達量分別為1.000±0.248、1.036±0.155、0.101±0.016，敲低組顯著低于空白對照組和陰性對照組(P值均<0.05)，表明構建慢病毒介導NOB1穩定敲低前列腺癌細胞PC-3和DU145。PC-3細胞的空白對照組、陰性對照組和敲低組NOB1蛋白質相對表達量分別為1.00±0.00，1.12±0.45、0.34±0.07；DU145細胞的空白對照組、陰性對照組和敲低組NOB1蛋白質相對表達量分別為1.00±0.00、0.96±0.13、0.13±0.04，兩種細胞敲低組的NOB1蛋白質相對表達量均顯著低于空白對照組和陰性對照組(P值均<0.05)，見圖2。上述實驗表明成功建立了穩定敲低NOB1的前列腺癌細胞株。

A PC-3細胞 B DU145細胞 1 空白對照組 2 陰性對照組 3 敲低組

2.3 敲低NOB1后前列腺癌細胞PC-3、DU145細胞增殖活性變化 實驗第3、4、5天，PC-3、DU145細胞敲低組A595值均顯著低于各自陰性對照組同時間(P值均<0.05)，細胞增殖率被抑制70%以上。見表1。

組別時間PC-3DU145空白對照第1天0.133±0.0210.111±0.010第2天0.258±0.0170.171±0.021第3天0.641±0.0490.266±0.014第4天0.961±0.0740.849±0.004第5天1.216±0.1110.968±0.018陰性對照第1天0.141±0.0140.114±0.011第2天0.261±0.0070.171±0.013第3天0.721±0.048①0.274±0.014①第4天0.915±0.088①0.832±0.434①第5天1.117±0.094①1.105±0.061①敲低第1天0.118±0.0150.108±0.007第2天0.202±0.0300.140±0.001第3天0.444±0.0410.183±0.018第4天0.658±0.0600.549±0.016第5天0.784±0.0680.662±0.047

與同細胞敲低組同時間比較：①P<0.01

2.4 敲低NOB1后前列腺癌細胞PC-3、DU145細胞周期變化 PC-3和DU145細胞陰性對照組的G0/G1期細胞百分比均顯著低于敲低組(P值均<0.05)，S期細胞百分比均顯著高于敲低組(P值均<0.05)。見表2。

組別細胞周期PC-3DU145空白對照G0/G161.05±1.1747.11±1.90S21.66±1.0735.31±1.69G2/M18.81±0.3219.14±2.22陰性對照G0/G161.30±0.99①43.87±1.23①S20.68±1.09①36.12±1.33①G2/M18.87±0.6021.25±3.15敲低G0/G166.26±1.7951.14±1.49S17.50±0.6132.77±1.07G2/M17.86±1.4218.05±0.67

與同細胞敲低組同細胞周期比較：①P<0.05

2.5 敲低NOB1后前列腺癌細胞PC-3和DU145的侵襲能力變化 PC-3細胞空白對照組、陰性對照組和敲低組遷移細胞數分別為(634±41)、(630±48)、(113±17)個/高倍視野，DU145細胞空白對照組、陰性對照組和敲低組遷移細胞數分別為(350±23)、(351±12)、(85±10)個/高倍視野，兩種細胞敲低組的遷移細胞數均顯著低于陰性對照組和空白對照組(P值均<0.01)。見圖3。

A PC-3細胞空白對照組 B PC-3細胞陰性對照組 C PC-3細胞敲低組 D DU145細胞空白對照組 E DU145細胞陰性對照組 F DU145細胞敲低組

2.6 敲低NOB1可以抑制c-Src磷酸化 為進一步研究NOB1 的功能，本實驗在前列腺癌細胞株PC-3和DU145中敲低NOB1，發現前列腺癌細胞在感染了NOB1 干擾慢病毒后，細胞形態變得狹長，呈梭狀或紡錘狀。隨后采用Western印跡法檢測NOB1下游可能的信號通路變化情況，PC-3 細胞陰性對照組和敲低組c-Src(tyr416位點)的磷酸化半定量結果分別為1.000±0.000、0.347±0.07，DU145細胞陰性對照組和敲低組c-Src(tyr416位點)的磷酸化半定量結果分別為1、0.439±0.073，兩種細胞敲低組c-Src(tyr416位點)的磷酸化半定量均顯著低于各自陰性對照組(P值均< 0.01)。見圖4。

A PC-3細胞 B DU145細胞 1 陰性對照組 2 敲低組

3 討 論

由于前列腺癌發病隱匿，早期難以發現，故臨床上以中晚期患者為多，我國中晚期前列腺癌患者占總發病人群的60%[12]。前列腺癌的轉移常見，尤其是骨轉移，超過90%的前列腺癌轉移患者會發生骨轉移[13]。腫瘤細胞的轉移是導致前列腺癌術后復發的主要原因。因此，對前列腺癌轉移分子機制的研究，為進一步開發有效的治療手段提供重要依據，對提高患者生存率具有重要的臨床意義。

本研究團隊在前期工作中比較了前列腺癌與癌旁組織中NOB1的表達水平，并分析患者預后；結果顯示，NOB1在前列腺癌組織中高表達，且與前列腺癌的惡性程度相關[11]，提示NOB1可能參與調控前列腺癌細胞的惡性增殖和侵襲性轉移。本研究構建了靶向敲低NOB1基因的shRNA慢病毒，檢測NOB1敲低后的前列腺癌細胞功能表型的改變。MTT實驗結果顯示，實驗第3、4、5天PC-3、DU145細胞敲低組A595值均顯著低于陰性對照組同時間，細胞增殖率被抑制70%以上，提示NOB1基因被沉默后，前列腺癌細胞PC-3、DU145的增殖能力降低；流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，PC-3、DU145細胞陰性對照組的G0/G1期細胞百分比均顯著低于敲低組，S期細胞百分比均顯著高于敲低組，提示NOB1被敲低后，前列腺癌細胞PC-3、DU145細胞周期停滯于G0/G1期；Transwell實驗結果顯示，PC-3、DU145細胞敲低組的遷移細胞數均顯著低于陰性對照組和空白對照組，提示敲低NOB1后可使前列腺癌細胞PC-3、DU145的侵襲能力降低；Western印跡法檢測結果顯示，PC-3、DU145細胞敲低組c-Src(tyr416位點)的磷酸化半定量均顯著低于陰性對照組，提示敲低NOB1后可使前列腺癌細胞PC-3、DU145中c-Src的tyr416位點磷酸化水平顯著降低。上述實驗結果表明，NOB1被敲低后，前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力均被抑制，這種細胞表型的變化可能與c-Src(tyr416位點)磷酸化被抑制有關。

c-Src是非受體酪氨酸激酶家族的重要成員[14]，是細胞運動能力調控中的一個關鍵性酪氨酸蛋白激酶，其通過肌動蛋白應力纖維的拆卸、絲足體的組裝和黏著斑的動態平衡調控細胞的運動能力[15]。c-Src活性通過蛋白相互作用和磷酸化進行調控，c-Src上有2個重要的磷酸化位點Y416和Y530，前者的磷酸化通過c-Src 的構象改變激活其激酶活性，后者的磷酸化可通過c-Src 內部折疊來抑制其激酶活性的發揮[16]。活化的c-Src通過磷酸化下游底物如雄激素受體、磷脂酰肌醇3-激酶信號通路發揮提高前列腺癌細胞增殖能力的作用；通過磷酸化激活Ezrin、Contractin、Paxilin和Rho鳥苷三磷酸酶等促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力；通過磷酸化激活絲裂原活化蛋白激酶、信號轉導和轉錄激活因子3等發揮促血管生成作用[17-18]。c-Src是腫瘤細胞獲得轉移潛能的核心分子[19-20]。本研究發現，敲低NOB1可以明顯抑制c-Src的tyr146位點磷酸化，該位點是激活c-Src激酶活性所必需的，可以推測NOB1很可能是通過促進c-Src磷酸化促進前列腺癌的轉移。

綜上所述，NOB1在前列腺癌細胞中的高表達可能通過上調c-Src激酶活性促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，進而促進腫瘤發生遠處轉移。但其具體的作用機制和信號通路仍有待進一步研究闡明。