慢性胰腺炎患者腸道微生態的變化及其與胰腺內外分泌功能不全的關系

孟雨亭 徐佳佳 周春華 趙九龍 周 瑋 蔣 琪 張 堯 鄒多武

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一種以胰腺的病理性纖維化為特征的炎性綜合征，臨床表現為反復上腹痛、胰腺炎急性發作，以及胰腺內外分泌功能不全。胰腺內分泌功能不全主要表現為糖尿病，與1型和2型糖尿病不同，CP繼發性糖尿病主要由胰島細胞損傷引起，屬于3C型糖尿病(type 3 diabetes mellitus, T3DM)[1]。胰腺外分泌功能不全(pancreatic exocrine insufficiency,PEI)可導致脂肪和其他營養物質消化不良，PEI程度可通過糞彈力蛋白酶1(fecal elastase 1,FE1)水平來反映。

腸道微生物是宿主代謝的重要組成部分，在機體免疫的平衡和紊亂中起著重要作用[2]。微生態失調與多種胃腸道疾病(炎癥性腸病、腸易激綜合征)[3-4]，以及肥胖、代謝綜合征、糖尿病、胰腺癌等其他疾病的發病機制有關[5-7]。約有36%的CP患者可出現小腸細菌過度生長(small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)[8]。近年來，有少數國外研究團隊關注到CP患者存在不同程度的腸道微生態失調，并且這種紊亂與炎性反應、胰腺纖維化有關，同時，伴有T3DM的CP患者微生態紊亂情況更加明顯[9-10]。此外，2018年的一項大樣本研究[11]發現，FE1水平的變化與其他因素(如年齡、性別、BMI等)相比，可以在更大程度上反映腸道微生物的變化。本研究旨在探討伴有T3DM的CP患者腸道微生態的變化，以及這種變化與T3DM和PEI的關聯。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年8月—2018年9月間在上海長海醫院消化內科住院治療的CP患者，其中CP不伴糖尿病者(不伴糖尿病組)30例和CP伴糖尿病者(伴糖尿病組)31例，另選擇與患者一起生活至少10年的健康家屬60名作為對照組。CP患者診斷標準參照亞太共識[12]，所有受試者的年齡限制為18～60周歲，排除標準：近1個月內使用過抗生素，嚴重酗酒，患有腸易激綜合征、肥胖、肝病等慢性疾病，DNA提取質量不佳。本研究經上海長海醫院倫理委員會批準，每位參與者均簽署知情同意書。

1.2 樣本收集方法 通過上海長海醫院住院病歷系統收集CP患者的臨床資料，檢測并記錄對照組的BMI和空腹血糖(fast blood glucose,FBG)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)水平。使用無菌容器收集所有受試者的糞便樣本后，置于盛滿冰塊的容器中于2 h內送至實驗室，儲存于-80℃冰箱用于下一步檢測分析。

1.3 腸道微生物測序 腸道菌群的測序流程主要包括脫氧核糖核酸(DNA)提取、靶基因的PCR和高通量測序。按照標準操作流程，使用糞便DNA快速提取試劑盒[安倍醫療器械貿易(上海)有限公司]進行DNA提取。應用PCR擴增系統(GeneAmp 9700, 美國ABI公司)對各樣本16S核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid,rRNA)的V3、V4區域進行擴增，正向、反向引物分別為338F (5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3’)、806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)。使用AxyPrepDNA (美國Axygen公司)凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收純化，并應用FLx800酶標儀(美國BioTek公司)對回收產物進行熒光定量。將擴增產物等量匯集，應用Illumina MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序。

1.4 高通量測序數據處理 高通量測序的原始數據在分析前需要進行處理和質量控制，本研究的原始數據格式為FASTQ格式。首先采用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一作質量篩查。隨后應用FLASH軟件(http:∥ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對通過質量初篩的雙端序列根據重疊堿基進行配對連接。最后，根據每個樣本所對應的索引信息(即條碼序列，為序列起始處用于識別樣本的一小段堿基序列)，將連接后的序列識別分配入對應樣本(要求索引序列完全匹配)，從而獲得每個樣本的有效序列。應用UPARSE軟件(http:∥drive5.com/uparse/)、相似性閾值設定為97%，對通過質量篩選的序列進行聚類，獲得操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。采用核糖體數據庫(ribosomal database project, RDP)分類算法(http:∥rdp.cme.msu.edu/)，對照16S rRNA數據庫 (http:∥www.arb-silva.de)，對獲得的OTU進行分類，置信度閾值為70%，可以獲得各樣本門、綱、目、科、屬、種水平微生物的豐度表。通過京都基因和基因組全書 (Kyoto enclyopedia of genes and genomes, KEGG)同源性分析[13]，對每個樣本的代謝通路進行預測。

1.5 FE1檢測 使用FE1檢測試劑盒(德國ScheBO?·Biotech AG公司)按照標準操作流程進行。首先使用ScheBO?·Master Quick-PrepTM樣品準備系統對糞便樣品進行取樣和抽提，之后將10 μL提取物加入900 μL緩沖液進行稀釋。將標準品、對照品和稀釋后的樣品各50 μL分別加入96孔板，于室溫下孵育30 min，隨后每孔加入抗彈力蛋白酶1-生物素-過氧化物酶-鏈霉親和素復合物(anti-E1-biotin-peroxide-streptavidin-complex)50 μL在室溫黑暗條件下孵育15 min，最后每孔加入100 μL底物進行顯色反應。加入100 μL終止溶液終止顯色反應后，應用酶標儀進行檢測，檢測波長405 nm，參考波長492 nm。應用ELISA分析軟件進行數據分析和標準曲線構建，最終得到每個樣品的FE1質量比(μg/g)。

2 結 果

2.1 一般資料 伴糖尿病組FBG水平顯著高于不伴糖尿病組和對照組，而Hb水平顯著低于不伴糖尿病組和對照組(P值均<0.01)。見表1。伴糖尿病組的病程顯著長于不伴糖尿病組、胰腺萎縮率顯著高于不伴糖尿病組、FE1水平顯著低于不伴糖尿病組(P值均<0.01)。見表2。

表1 所有受試者的一般資料比較

與伴糖尿病組比較，①P<0.01

表2 伴糖尿病組與不伴糖尿病組患者的臨床特點比較

ERCP為內鏡下逆行胰膽管造影術，ESWL為體外沖擊波碎石術。與伴糖尿病組比較：①P<0.01

2.2 菌群多樣性分析 通過對高通量測序原始數據的質控和修剪后，按照樣本中最小序列數，將所有樣本的序列數隨機抽取至統一數據量，平均每個樣本有19 139條高質量序列。總OTU為2 791個，其中伴糖尿病組獨有的OTU為128個，不伴糖尿病組獨有的OTU為71個，對照組獨有的OTU為1 200個。通過α多樣性分析得到每個樣本的α多樣性指數，并對指數間的差異進行統計學檢驗。結果顯示，3組間的Shannon、Ace、Chao1、Sobs、PD、Coverage指數的差異均有統計學意義(P值均<0.05)。見表3。通過OTU水平上的Sobs指數構建稀疏曲線，可見隨著樣本數量增加，所測得OTU數量逐漸趨于穩定，提示本研究測序數據量足夠(圖1)。進一步分析表3的數據發現，從對照組到不伴糖尿病組再到伴糖尿病組，Sobs和Shannon指數逐漸降低；說明隨著疾病持續時間和嚴重程度增加，腸道微生態的多樣性和豐富性逐漸降低。

組別NShannonSimpsonAceChao1SobsPDCoverage對照 603.487±0.7200.097±0.073406.6±235.0399.92±219.98309.15±164.3926.28±14.770.996±0.002不伴糖尿病303.202±0.6630.128±0.099292.0±68.5295.81±71.71232.07±61.0419.53±4.370.997±0.001伴糖尿病313.085±0.5200.117±0.070305.5±136.5302.15±138.23231.10±103.2720.48±8.290.997±0.002

圖1 通過Sobs指數構建的稀疏曲線

2.3 群落組成和差異物種分析 通過OTU表比對，進一步在門水平和屬水平上對3組樣本的菌群結構進行分析。

在群落構成上，3組樣本的菌群種類基本一致，均主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門微生物構成(圖2)，但各物種豐度有明顯差異。從對照組到不伴糖尿病組再到伴糖尿病組，厚壁菌門豐度逐漸下降，變形菌門豐度逐漸上升。見表4。

圖2 3組樣本主要物種構成比較

3組樣本中相對豐度>1%的屬共有27個，相對豐度差異有統計學意義的屬有6個，包括埃希菌-志賀菌屬、小桿菌屬、普氏菌_7屬、假單胞菌屬、普氏菌_9屬和真細菌屬，其中小桿菌屬、普氏菌_7屬在伴糖尿病組中顯著富集，埃希-志賀菌屬、普氏菌_9屬在不伴糖尿病組中顯著富集，對照組則是假單胞菌屬較為富集。見表5。

對這6個3組間豐度差異有統計學意義的菌屬進行相關性分析(圖3)，結果顯示，伴糖尿病組中顯著富集的小桿菌屬與普氏菌_7屬呈顯著正相關關系(r=0.323,P=0.000 3)，推測這兩種致病菌間可能存在共生關系。埃希-志賀菌屬與普氏菌_9屬、真細菌屬呈顯著負相關(r=-0.244,P=0.007;r=-0.266,P=0.003)，普氏菌_9屬與假單胞菌屬、真細菌屬呈顯著正相關(r=0.388,P<0.001;r=0.398,P<0.001)，小桿菌屬與真細菌屬呈顯著正相關(r=0.210,P=0.021)，假單胞菌屬與真細菌屬呈顯著正相關(r=0.206,P=0.023)。

與對照組比較：①P<0.05，②P<0.01

表5 3組樣本在屬水平的物種相對豐度比較 [M(P25, P75)，%]

與對照組比較：①P<0.05

色軸為相關性r值，色塊內數值為P值

2.4 重要性物種分析 通過LDA分析發現，普氏菌_7屬是伴糖尿病組的重要物種，LDA值為3.8；普氏菌_9屬、真細菌屬是不伴糖尿病組的重要物種，LDA值分別為4.3和3.7；假單胞菌屬則是對照組的重要物種，LDA值為4.1。結合差異物種分析，可以進一步證明各組中顯著富集的物種也是在組間差異中起重要作用的物種。

2.5 KEGG通路預測及其與菌群變化的關系 通過KEGG同源分析預測3組受試者代謝通路變化情況，并與組間差異有統計學意義的菌屬進行關聯分析。發現CP患者有多條代謝通路出現顯著變化，其中伴糖尿病組脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)合成通路和LPS生物合成蛋白通路顯著富集。見表6。將LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路相對豐度與小桿菌屬和普氏菌_7屬相對豐度進行相關性分析，結果顯示，小桿菌屬與LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路有正相關趨勢(r=0.097,P=0.288;r=0.043,P=0.643)，普氏菌_7屬豐度與LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路呈顯著正相關(r=0.295,P=0.001;r=0.262,P=0.004)。

表6 3組樣本部分差異有統計學意義的代謝通路比較 [M(P25, P75)]

與對照組比較：①P<0.01

2.6 腸道菌群變化與宿主臨床指標相關性分析 進一步分析61例CP患者臨床特征與相對豐度>1%的菌屬的相關性，結果顯示，普氏菌_7屬相對豐度與FE1、BMI水平呈顯著負相關(r=-0.425,P=0.001;r=-0.275,P=0.042)，瘤胃球菌屬與BMI水平呈顯著正相關(r=0.364，P=0.006)，副桿菌屬與FE1、FBG水平呈顯著正相關(r=0.285,P=0.035;r=-0.494,P<0.001),與Hb水平呈顯著負相關(r=0.360,P=0.007)。

對FBG水平與LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路相對豐度進行相關性檢驗，結果顯示，FBG與這兩個通路相對豐度有呈正相關的趨勢，但無統計學意義(r=0.114,P=0.215;r=0.128,P=0.160)。

3 討 論

本研究納入CP患者的健康家屬作為對照，可以在最大程度上排除飲食、地理因素和民族起源對腸道微生物組成的影響[14-16]。

首先，本研究發現CP患者，尤其是伴有糖尿病的患者腸道微生態多樣性和豐富性顯著低于對照組。伴糖尿病組的患者病程顯著長于不伴糖尿病組的患者，而BMI、FE1、Hb水平顯著低于不伴糖尿病組的患者；因此推斷CP病程越長，其腸道微生態紊亂情況越嚴重，這一結果與Jandhyala等[9]的研究結果類似。

第二，本研究分析了3組樣本在門水平和屬水平上差異有統計學意義物種，發現變形菌門、小桿菌屬和普氏菌_7屬在伴有糖尿病患者的腸道菌群中顯著富集，推測這3種菌屬可作為診斷CP并發糖尿病的輔助手段。變形菌門的細胞外膜存在LPS，由LPS維持的低度炎性反應與代謝紊亂之間的聯系已被證實[17]。小桿菌屬能夠產生乙酸鹽和丙酸鹽，但不能產生丁酸鹽。丁酸鹽和丙酸鹽屬于腸道微生物通過合成糖苷水解酶分解碳水化合物產生的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)，SCFA信號通過中樞神經系統和G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCR)來調節一系列生理過程，包括能量穩態、脂質和碳水化合物代謝和炎性反應信號的抑制[18]。此外，丁酸鹽可能具有免疫調節作用[19]，因此小桿菌屬可能對宿主有潛在的負面(炎性反應)和正面(通過SCFA)效應，而整體效應可能通過與其他細菌的相互作用來確定[20]。普氏菌屬是一種革蘭陰性厭氧菌，是3種細菌腸型之一的中心成分[21]。既往研究發現，普氏菌屬豐度增加與非糖尿病胰島素抵抗[22]、病態肥胖[23]和非酒精性脂肪性肝病[24]相關。近年來的研究[25]結果表明，普氏菌屬與炎癥性疾病的關系有高度異質性，與宿主危險因素和環境的復雜相互作用有關，特定的普氏菌屬物種可能表現出不同的特性。本研究中，伴糖尿病組患者普氏菌_7屬豐度明顯升高。

第三，KEGG代謝通路預測和FE1檢測發現，伴糖尿病組患者的LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路顯著活躍，這兩條代謝通路豐度與普氏菌_7屬豐度呈顯著正相關；同時伴糖尿病組患者的FE1水平顯著低于不伴糖尿病組，且FE1水平與普氏菌_7屬豐度呈顯著負相關。LPS可通過Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)和NF-κB誘導胰島β細胞炎性反應，從而導致β細胞功能障礙[26]。因此，推測普氏菌_7屬豐度可作為診斷CP并發胰腺內外分泌功能不全的輔助手段。

綜上所述，CP患者伴有顯著的腸道微生態失調，其中伴有糖尿病的CP患者菌群失調情況更嚴重，變形菌門、小桿菌屬和普氏菌_7屬豐度顯著升高可作為輔助診斷CP并發糖尿病的依據，同時普氏菌_7屬亦可輔助判斷CP患者胰腺外分泌功能狀況。菌群失調是CP的原因或僅僅是CP的結果目前尚不清楚，需要進一步設計完善的臨床和基礎研究來驗證本研究結果并闡明其作用機制。