己酮可可堿調節微RNA-122和過氧化物酶體增殖物激活受體α減輕酒精性肝炎大鼠肝損傷

白志金 田曉娟 丁瑞峰

酒精性肝病(ALD)是我國常見的慢性肝病之一[1]。臨床上將ALD分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝(AFL)、酒精性肝炎(AH)、酒精性肝纖維化(AHF)和酒精性肝硬化。目前，AH的發病機制仍然不完全明確，推測與乙醇引起的脂質代謝紊亂、氧化應激反應、肝細胞炎性反應等相關。微RNA(miRNA)-122定位于人染色體18q21.31[2]，約占成年個體肝臟總miRNA的72%。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)為miRNA-122的靶基因，屬于過氧化物酶體增殖物激活受體家族(PPARs)中一員。本研究旨在探討己酮可可堿(PTX)對AH大鼠肝功能的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼料 7～8周齡清潔級Wistar雄性大鼠30只，體重為(190±20)g，均由內蒙古醫科大學動物中心供應，許可證號為SCXK(蒙)2015-0001。高脂飼料以普通飼料、膽固醇、豬油按質量比87∶3∶10混合固定成型后輻照滅菌。

1.2 主要試劑和儀器 石蠟包埋組織切片miRNA-122提取試劑盒、miRNA-122及其互補DNA(cDNA)第一鏈合成試劑盒、miRNA-122熒光定量檢測試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR 引物購自南京博爾迪生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自美國Bio-Rad公司；GAPDH一抗(ab8245)和PPAR-α一抗(ab3484)購自美國Abcam公司；羊抗鼠二抗(ZB-2305)和羊抗兔二抗(ZB-2301)購自北京中杉金橋公司；ECL顯影液(sc-2048)購自美國Santa Cruz公司。5804R低溫高速離心機、紫外分光光度計為德國Eppendorf公司產品，Trans-Blot SD半干轉電轉印儀和Powerpac HQ穩壓穩流電泳儀為美國Bio-Rad公司產品，計算機圖像分析儀為美國IPP公司產品，實時PCR儀為中國杭州朗基公司產品；凝膠成像儀為中國上海天能公司產品。

1.3 大鼠的分組和處理 將實驗大鼠隨機分入空白對照組(對照組)、AH模型組(模型組)和PTX組，每組10只。3組大鼠均予普通飼料進行適應性喂養1周，之后模型組和PTX組改用梯度乙醇灌胃輔以高脂飲食造模，方法參照前期實驗[3]和文獻[4-5]的方法并加以改進，即以高脂飼料飼喂;1～3周予35%乙醇6.0 g/(kg·d)，4～6周予40%乙醇7.0 g/(kg·d)、7～9周予45%乙醇8.0 g/(kg·d)，10～12周予50%乙醇9.0 g/(kg·d)，均于每日上午9:00灌胃。對照組在同時段予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。PTX組從第9周開始于每日15:00加用PTX灌胃，按成人和大鼠體表面積和藥效等效劑量計算PTX劑量為9 mg/(kg·d)[6]，持續4周；對照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。造模時間共12周。造模結束后，各組大鼠禁食12 h，按各組序號依次稱重，腹腔內注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，經腹主動脈采血4 mL，按壓止血。立即切除兩側肝韌帶，完整摘取肝臟后置于無菌盒內稱重。計算肝指數(肝濕重/體重×100%)。

1.4 血液檢測 將血液標本放置10～20 min凝固，必要時可置37 ℃恒溫箱中促凝，以1 006.2×g離心10 min。應用全自動生化儀檢測血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、白蛋白水平。

1.5 肝組織病理學檢查 取大小為2.0 cm×2.0 cm的大鼠新鮮肝臟右葉組織2塊，分別置入液氮和包埋盒中，用40%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，經H-E染色后置于光學顯微鏡下觀察。

1.6 實時PCR檢測大鼠肝組織 miRNA-122的表達 取上述大鼠肝臟石蠟標本切片10片分別裝入1.5 mL Eppendorf(EP)管中，應用miRNA提取試劑盒對不同樣本內的總RNA進行提取，再分別檢測其濃度。應用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈試劑盒，提取RNA和完成反轉錄。條件為42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。以cDNA為主，參照增強型miRNA熒光實時測定試劑中體系熒光強度。PCR過程：95 ℃總變性15 min，94 ℃重新變性20 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。完畢后，明確擴增曲線、熔解曲線，PCR反應結束后讀取Ct值，利用熒光定量檢測儀計算 2-ΔΔCt,并分析 miRNA-122 在各個樣本中的表達情況。PCR引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.7 Western印跡法檢測大鼠肝組織PPAR-α蛋白質表達 從液氮中取出大鼠肝組織，加入預冷的PBS洗滌組織，將放射免疫沉淀裂解液(RIPA裂解液)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑按體積比100∶1∶1配制裂解液，每管加入500 μL裂解液，均化后于4 ℃ 15 min裂解。以1 006.2 ×g離心10 min后，取上清液測定蛋白質濃度。倒入緩沖液混勻，沸水煮10 min變性；經10%SDS-PAGE凝膠電泳，偏聚二氟乙烯(PVDF)薄膜電轉印。以5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入一抗(PPAR-α抗體效價為1∶1 000)4 ℃孵育過夜；洗膜加入相應來源的HRP二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，充分洗膜后經ECL顯影，于X線下壓片、曝光；應用IPP軟件分析條帶。

2 結 果

2.1 一般情況比較 對照組大鼠精神良好，飲食佳，活動可，反應靈敏，毛色光澤，飼養期間體重逐漸增加。模型組和PTX組大鼠精神萎靡，飲食差，嗜睡，反應遲鈍，毛色無光澤，有脫毛、掉毛現象,造模期間體重下降明顯；在給予藥物干預后，PTX組大鼠精神、飲食較前好轉，嗜睡程度減輕，脫毛、掉毛現象好轉，體重呈上升趨勢。

2.2 大鼠體重、肝重和肝指數比較 對照組大鼠體重顯著高于模型組和PTX組(P值均<0.01)；PTX組大鼠體重顯著高于模型組(P<0.01)。模型組和PTX組大鼠肝重、肝指數均顯著高于對照組(P值均<0.01)，PTX組大鼠肝重、肝指數均顯著低于模型組(P值均<0.01)。見表2。

組別體重(g)肝重(g)肝指數(%)對照組348.10±8.929.57±0.582.75±0.11模型組296.20±9.13①13.05±1.05①4.40±0.31①PTX組316.10±10.18①②11.31±0.77①②3.59±0.33①②

與對照組比較：①P<0.01。與模型組比較：②P<0.01

2.3 大鼠肝功能指標比較 模型組和PTX組血清ALT、AST、GGT水平均顯著高于對照組(P值均<0.05)，白蛋白水平均顯著低于對照組(P值均<0.05)；PTX組血清ALT、AST、GGT水平均顯著低于模型組(P值均<0.05)，白蛋白水平顯著高于模型組 (P<0.05)。見表3。

表3 大鼠肝功能指標比較

與對照組比較：①P<0.05。與模型組比較：②P<0.05

2.4 大鼠肝組織H-E染色結果 對照組大鼠肝組織小葉結構清晰、完整，肝細胞形態規則、排列緊密，肝索從中央靜脈起始，呈放射狀有序排列。模型組大鼠肝組織肝細胞變性、腫脹，有較多脂肪空泡，可見脂肪變性，有中性粒細胞和淋巴細胞浸潤。與模型組比較，PTX組肝細胞的損傷、脂肪變性、炎性細胞浸潤均有不同程度減輕。見圖1。

A 對照組 B 模型組 C PTX組

2.5 實時PCR法檢測大鼠肝組織miRNA-122的表達 模型組和PTX組miRNA-122的相對表達量分別為13.02±3.46和3.45±1.94，均較對照組(1.00±0.00)顯著上調(P值分別<0.01、0.05)；PTX組miRNA-122相對表達量較模型組顯著下調(P<0.01)。

2.6 Western印跡法檢測大鼠肝臟組織中PPAR-α蛋白質的表達 模型組和PTX組大鼠肝組織PPAR-α蛋白質相對表達量分別為0.52±0.11和0.74±0.08，均顯著低于對照組的1.14±0.16(P值均<0.01)；PTX組大鼠肝組織PPAR-α蛋白質相對表達量顯著高于模型組(P<0.01)。見圖2。

1 對照組 2 模型組 3 PTX組

3 討 論

ALD發展進程中，AH是非常關鍵的階段，炎性反應被認為是影響ALD預后的主要因素[7]，所以在AH階段進行干預治療具有重要意義。目前，AH治療并無特效藥物，因此研究可能用于治療AH的藥物和了解相關藥物的作用靶點亦具有重要意義。

miRNA-122可以反映肝臟組織的病理學改變。Zhang等[8]的研究證實，miRNA-122在酒精性肝損傷時會升高，并且與肝臟的病理學變化一致。miRNA-122的靶基因PPAR-α屬于配體依賴性轉錄因子核受體超家族，介導脂質能量代謝和炎性反應相關基因的表達。有研究[9]結果表明，ob/ob肥胖小鼠肝臟中miRNA-122表達量的下降能夠導致其靶基因PPAR-α的蛋白質表達的增加。

PTX有較好的抗炎和抗免疫效果，能夠對氧化應激反應起到一定的抑制作用[3-4]。本研究發現，予大鼠高脂飲食和乙醇灌胃后，模型組和PTX組大鼠均出現不同程度易怒、飲食減少、消瘦、精神差等癥狀，肝重、肝指數，以及血清ALT、AST、GGT水平均高于對照組，白蛋白水平均顯著低于對照組；H-E染色結果提示，模型組的肝組織呈現出脂肪變性、氣球樣變，炎性細胞有高度浸潤的現象，說明造模成功。經過藥物干預，PTX組大鼠一般情況好轉，與模型組比較，體重有所上升，而肝重、肝指數和血清ALT、AST、GGT水平均下降，白蛋白水平上升；肝組織病理學變化也有所好轉，脂肪變性和炎性反應均有不同程度減輕。說明PTX具有減緩大鼠AH進展，改善病情的作用。

miRNA-122特異性表達于肝臟，廣泛參與肝臟的病理生理過程，對肝臟的生長、發育、代謝，對肝細胞異常增殖、凋亡、調控和參與肝臟疾病的形成，均有一定的作用。Laterza等[10]發現，miRNA-122對肝臟的損傷較ALT、AST等傳統標志物的特異度和敏感度更高，且與肝臟組織病理學變化更具相關性，提出miRNA-122可作為獨立的肝臟組織損傷的生物學標志物。動物研究[8,11]發現，在酒精性肝損傷時外周血和肝臟miRNA-122有明顯上調。本研究發現，AH大鼠肝臟 miRNA-122存在特異性高表達，在PTX干預后miRNA-122表達下調，提示PTX可能通過下調miRNA-122表達來減輕大鼠酒精性肝損傷，從而改善AH的病情。

PPAR-α是miRNA-122的靶基因之一,可以減少氧化應激，抑制炎性反應，從而緩解乙醇對肝臟的損傷,PPAR-α還能通過調節脂肪酸的生成、氧化和儲存相關基因的表達來抑制脂肪在肝臟內的蓄積[12]。曹智麗[13]的研究結果表明,PPAR-α在ALD由AFL逐步進展為AH、AHF的過程中均具有重要阻遏作用，隨著肝臟受損的加重，PPAR-α蛋白質表達逐漸減少。

本研究結果顯示，在AH大鼠模型中miRNA-122的表達水平顯著升高，其靶基因PPAR-α表達下降，說明miRNA-122-PPAR-α途徑可能參與介導了AH的發生和發展。經過PTX干預，PTX組大鼠的一般情況、體重、肝重、肝指數、肝功能、肝臟病理學改變均較模型組好轉，并通過觀察miRNA-122和PPAR-α蛋白質的表達水平，發現miRNA-122表達水平下降時，PPAR-α蛋白質表達水平升高。這說明乙醇可能通過抑制PPAR-α蛋白質的表達使肝臟受損，而PTX可能通過上調PPAR-α的表達來抑制AH的進展。

綜上所述，PTX對大鼠AH具有一定的治療作用，其可能的分子機制為PTX通過下調miRNA-122和上調其靶基因PPAR-α,進一步調控PPAR-α下游靶基因的表達對大鼠AH發揮治療作用。