硝酸鹽注入方式對抑制硫酸鹽還原菌活性的影響*

王大威，張世侖，靖 波，杜 君，景 宏，馬 挺

（1.海洋石油高效開發國家重點實驗室，北京100028；2.中海油研究總院有限責任公司，北京100028；3.中海石油（中國）有限公司天津分公司，天津300452；4.南開大學生命科學學院分子微生物學與技術教育部重點實驗室，天津300071）

硫酸鹽還原菌（sulfate reducing bacteria，SRB）是一類可以利用硫酸鹽、硫代硫酸鹽乃至單質硫作為終端電子受體的厭氧微生物的總稱，以往的研究中所分離的 SRB 約有 18 個屬 40 多個種類［1］。SRB也可以在厭氧環境中利用硝酸鹽、有機酸等物質生存，廣泛存在于油藏、硫黃礦等氧氣缺乏的自然環境中［2］。硫酸鹽作為SRB生長代謝過程中的電子受體，會在細菌胞內被還原為亞硫酸鹽，并進一步還原為硫化氫、硫化亞鐵等對生產有害的物質。管道中的硫化氫會引起管道的腐蝕產生惡臭，可能導致維修人員中毒等安全事故［3］，產生的硫化亞鐵會污染原油，降低原油品質。在海上油田早期開發生產中，海水常被用于注入油井進行水驅開發，因此大量富含硫酸鹽的海水進入油藏，油藏內的SRB即可利用硫酸鹽大量擴增，加劇硫化氫的產生和腐蝕問題的出現。

目前，治理SRB 的方法主要包括物理法、化學法和生物法。物理方法包括紫外照射、膜法除鹽、機械除渣等，這些方法治理效果較好，但在現場條件下實施較為困難。化學法包括使用氯酸鈉等氧化型殺菌劑和季銨鹽類等非氧化型殺菌劑。此類方法治理效果明顯，但容易造成污染、細菌的耐藥性、且成本較高。生物法主要是利用硝酸鹽還原菌（nitrate-reducing bacteria，NRB）競爭性抑制SRB 生長的方法［4-10］，也稱為生物競爭排斥技術（biocompetitive exclusion，BCX）。該方法具體原理是向油藏內注入低濃度的硝酸鹽/亞硝酸鹽，相比于硫酸鹽，硝酸鹽/亞硝酸鹽更易成為電子受體，從而促進油藏內存在的NRB大量生長擴增，并與SRB競爭生存空間及底物，阻止SRB 獲得所需的生長營養物質，控制SRB的代謝活性。

目前生物競爭排斥技術已經在油藏SRB 治理中得到大量應用，但現場注入工藝一直是影響該技術使用效果的主要限制因素。筆者在室內研究的基礎上，以不同注入方式向模擬地層環境中注入硝酸鹽，激活NRB 抑制SRB，探索抑制SRB 活性的最佳硝酸鹽注入方式。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

地層水取自綏中油田某生產井，離子組成（單位 mg/L）為使用前在12000 r/min、4℃條件下離心20 min，然后在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。菌種取自綏中油田某生產井水樣，使用SRB 培養基（g/L）（0.5 KH2PO4、1.0 NH4Cl、1.0 Na2SO4、0.05 CaCl2、2.0 MgCl2·6H2O、1.0 酵母提取物（yeast extract）、0.1 抗壞血酸（VC）、0.1 CH3COONa、1.1 d-C3H6O3Na）、NRB培養基（g/L）（0.5 KH2PO4、1.0 NH4Cl、1.0 NaNO3、0.05 CaCl2、2.0 MgCl2·6H2O、1.0 yeast extract、0.1 VC、1.0 CH3COONa）在58℃下培養以富集水樣中的SRB 和NRB。培養基中的試劑購自天津希恩思生化科技有限公司、天津科密歐化學試劑有限公司、天津津東天正精細化工試劑廠等化學試劑公司。SYBR Green qPCR Master Mix（綠色熒光染料混合試劑），日本TaKaRa公司；硫酸鹽快速檢測試劑盒，英國Modernwater 公司；硫酸鹽還原菌水質測試瓶SRB-HX，北京華興化學試劑廠；Axygen 細菌基因組小提試劑盒（Lysis buffer、溶菌酶），美國Axygen公司；NaNO3、十二烷基硫酸鈉（SDS），分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

iQTM5 熒光定量 PCR 儀，美國 Bio-Rad 公司；臺式高速冷凍離心機，德國Sigma 公司；SpectroDirect分光光度計，德國羅威邦公司；硫化氫檢測管，德國德爾格公司。

1.2 實驗方法

（1）現場采樣

取25 L 干凈塑料桶用醫用酒精洗2數3 遍，備用；根據井口壓力選擇性接上高（低）壓取樣器，打開取樣閥，讓采出液流出5數10 min 并沖洗塑料桶2數3 遍；將采出液灌滿塑料桶（不留空氣體積），每口井25 L（其中原油至少1 L，地層水至少10 L），擰緊蓋子密閉常溫保存（注意冬季防凍結、夏季防暴曬）；樣品采集后盡快運送至實驗室進行樣品預處理。

（2）模擬實驗

用地層水將SRB 培養基稀釋10 倍，用SRB 測試瓶培養SRB和NRB。以地層水為培養基，滅菌后以1%的接種量接入SRB和NRB，使SRB和NRB的接入量與油藏中的比例相同。設置每日0、20、40、80 mg/L 和每 5 d 100、200、400 mg/L 的硝酸鹽注入梯度，根據現場實際注入濃度，研究不同硝酸鹽注入濃度、注入方式（每天注入、一次性注入）下，硫化氫濃度、SRB 和 NRB 數量的變化，得到現場的最佳注入方式。

（3）樣品DNA的提取和保存

取菌液20 mL 于離心管中，12000 r/min 離心10 min；菌體使用1 mL Lysis buffer 洗兩次后，用0.6 mL Lysis buffer重懸并加入0.2 g玻璃珠研磨1 min，重復3次，使用終濃度為10 mg/mL的溶菌酶在37℃下反應1 h，加入120 μL 20%的SDS 在65℃下反應1 h，之后按照Axygen細菌基因組小提試劑盒第5步開始完成后續提取，具體方法步驟參照說明書。

（4）SRB和NRB數量測定

使用實時熒光定量PCR儀進行定量，使用SRB共有基因上游引物dsrF：CAACATCGTYCAYACCCAGGG和SRB共有基因下游引物dsrR：GTGTAGCAGTTACCGCA 對 SRB 進行絕對定量；使用NRB 共有基因上游引物napAF：CTGGACIATGGGYTTIAACCA 和NRB 共有基因下游引物napAR：CCTTCYTTYTCIACCCACAT 對 NRB 進行絕對定量。

（5）培養液中各離子和硫化氫濃度的測定

在 500 mL 油水體系中加入 200、400 mg/L 的抑制藥劑（NaNO3），混合均勻后置于58℃恒溫培養箱中，定時取樣檢測和中間產物的濃度，分析模擬油藏條件下，油藏中的SRB、NRB菌群對抑制藥劑的代謝速率和特性，為現場注入工藝調整提供技術支持。

2 結果與討論

2.1 離子濃度的變化

圖1 硝酸鹽注入方式對硫酸根濃度的影響

圖2 硝酸鹽注入方式對硝酸根濃度的影響

圖3 硝酸鹽注入方式對亞硝酸根濃度的影響

2.2 H2S濃度的變化

H2S是SRB作用后的代謝產物，分析H2S濃度可了解SRB抑制效果。由圖4可知，對比空白組，加入藥劑組（第2數7組數據點完全重合）自始至終沒有硫化氫的產生，說明無論每日加藥方式和一次性加藥方式對抑制SRB產生S2-均有顯著的效果。

圖4 硝酸鹽注入方式對硫化氫濃度的影響

2.3 SRB、NRB菌數的變化

硝酸鹽注入方式對SRB、NRB菌數的影響見圖5。空白組SRB 菌數在前4 d 持續增長，在第4 d SRB 菌數達到2.89×104個/mL，這正好與圖1中第4大量消耗相對應，說明SRB 利用大量增殖，同時也造成濃度下降，此后SRB 開始減少，但由于SRB 濃度尚維持在一定水平的消耗速率并未明顯降低，說明體系內的濃度降低后，SRB 因無可用而產生數量上的降低。加藥組中，SRB、NRB 濃度均有一定升高，說明加入的激活了體系內的NRB，同時SRB也能優先利用高濃度的而增殖，因此即使在加入藥劑條件下，因的濃度變化，SRB數量也會呈現某種程度波動，但因為中間產物的存在及有機碳源等底物的消耗，SRB 濃度總體趨勢是下降的，且S2-產出明顯降低。對比圖5（a）、（b）可見，在加入藥劑的第1 d，SRB菌數降低，但隨后NRB菌數迅速回升并快速生長，一直到第3 d 生長至頂峰，隨后會因為及有機碳源的消耗，造成營養不足開始衰退。

實驗結果表明，一次性注入藥劑在初期對于NRB 的增殖效果要明顯優于每日注入等量藥劑的效果，說明在治理初期，體系內有機碳源含量高時，低濃度的無法直接抑制SRB，只有在NRB 存在的情況下，NRB 利用產生才能起到抑制作用，而高濃度大劑量的可以有效地抑制SRB。高濃度可誘導SRB 優先還原并產生中間產物從兩個方面抑制SRB，但此時NRB 的存在也會消耗體系內的引發SRB還原的過程。在治理中后期會繼續促使 SRB 利用有機碳源還原從而使其沒有足夠的碳源來還原同時NRB 的存在也會進一步消耗有機碳源，抑制SRB濃度作用更加明顯；另外，在SRB受到抑制后，持續加入的效果要優于一次性加入，具體表現為在停藥后一次性注入的SRB 反彈速度要高于持續加入，說明大劑量加藥在中后期的培養體系中及有機碳源由于在治理前期消耗過快，體系內剩余濃度不足，不能進一步抑制SRB 的生長，從而造成SRB反彈更快，而持續加藥的體系，盡管前期抑制效果不佳，但中后期體系內能保持一定的藥劑濃度，可持續對SRB產生抑制效果。

2.4 SRB、NRB對N的利用

圖5 硝酸鹽注入方式對細菌數量的影響

圖6 模擬地層條件下微生物對不同濃度的利用性

3 結論