手持式拉曼光譜快速鑒別部分頭孢菌素類原料

馮麗雄,彭 鶯,萬恒興

(深圳技師學院 應用生物系，廣東 深圳 518116)

2008版歐盟 GMP附件8《原輔包裝材料的取樣》法規對起始物料規定，起始物料取樣需要對每個包裝進行單獨取樣，獨立檢測鑒別[1]。中國2010版GMP也要求對每一包裝內的原輔料進行確認。確認方式包括逐一鑒別或核對確認，用于注射劑的原輔料需要逐一鑒別[2]。國內頭孢菌素內的原料廠家(華北制藥河北華民藥業，齊魯安替制藥有限公司，浙江永寧藥業股份有限公司，浙江普洛得邦制藥有限公司，深圳信立泰藥業股份有限公司，國藥集團致君(蘇州)制藥有限公司，珠海聯邦制藥股份有限公司，蘇州東瑞制藥有限公司，麗珠集團麗珠制藥廠，廣東立國制藥有限公司)均裝在鋁桶內，見圖1。鑒別需要對原料進行取樣，二次開桶對原料，特別是無菌原料，存在微生物污染的風險。對于非無菌原料，企業通過逐件的核對標簽信息，按照企業的制定取樣規則進行抽樣檢驗，通過供應商審核等措施，來避免物料的混淆，但還是無法符合歐盟審計要求[3]。

圖1 頭孢菌素原料鋁桶

2015年版中國藥典通則收錄拉曼光譜法為藥典方法[4]，拉曼光譜具有檢測時間短、 樣品量小，樣品無需處理、非接觸性、非破壞性等優點，可用于定性和定量檢測[5-6]。拉曼光譜在國內外逐漸被廣泛使用[7-8]。手持式快速拉曼分析儀具有體積小、質量輕、易于攜帶，適用于企業車間快速檢測[9]。

本文用對照品建立部分頭孢菌素原料拉曼光譜圖庫，通過命中率指數(hit quality index，HQI)對標準圖庫進行評價，并對鑒別的準確性進行驗證，方法運用于生產快速的鑒別，避免頭孢菌素類原料二次開桶微生物污染風險。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

瑞士萬通Mira M-1手持式快速拉曼分析儀，激光器(激發波長):785 nm；波長范圍: 400 ～ 2300 cm-1；光譜分辨率 12 ～ 14 cm-1(半峰寬) ；檢測方式：逐格掃描(orbital raster scan ，ORS)；曝光時間：自動模式；分析軟件：snowy range peak。

1.2 藥品

頭孢唑啉鈉(來源：華北制藥河北華民藥業；齊魯安替制藥有限公司)，頭孢地尼(來源：浙江永寧藥業股份有限公司；浙江普洛得邦制藥有限公司)，頭孢克肟(來源：浙江普洛得邦制藥有限公司；齊魯安替制藥有限公司)，頭孢西丁鈉(來源：深圳信立泰藥業股份有限公司；國藥集團致君(蘇州)制藥有限公司；華北制藥河北華民藥業)，頭孢噻肟鈉(來源：華北制藥河北華民藥業；珠海聯邦制藥股份有限公司；蘇州東瑞制藥有限公司)，頭孢曲松鈉(來源：麗珠集團麗珠制藥廠；齊魯安替制藥有限公司)，頭孢呋辛酯(來源：廣東立國制藥有限公司；珠海聯邦制藥股份有限公司)，頭孢呋辛鈉(來源：國藥集團致君(蘇州)制藥有限公司；廣東立國制藥有限公司；深圳信立泰藥業股份有限公司)；對照品來源(國藥致君(深圳)制藥有限公司中心化驗室)。

2 方法與結果

2.1 對照拉曼光譜圖庫建立

拉曼光譜圖庫中每個光譜代表一種原料。本文用選定研究對象的對照品來建立拉曼光譜圖庫。對照品裝在硼硅玻璃管制注射劑瓶中，選用短聚焦鏡頭(焦點聚鏡頭0.85 mm)掃描注射劑瓶底部位置，每個對照掃描6次，同個品種掃描的拉曼光譜通過軟件進行平均，作為對照拉曼光譜圖庫，見圖2所示。拉曼光譜相似性常用相似性函數、距離測度和峰匹配進行評價[10]。本文采用命中率指數相似性函數對光譜圖庫中兩個光譜進行初步評估。HQI在0和1之間，HQI越接近1，兩個光譜的相似程度越高。計算圖譜庫中任意兩個圖譜的HQI，設置HQI閾值為0.95，若HQI高于0.95，兩個拉曼光譜相似度高[11]。圖譜庫中若有兩個或兩個以上的圖譜的HQI高于0.95，產品存在錯誤鑒別的風險，須進行可行性評估。對照圖庫HQI矩陣結果見表1。HQI矩陣結果顯示，不同品種的之間的HQI均小于0.90。頭孢呋辛酯是頭孢呋辛的衍生物[12]，結構相似，相互的HQI為0.84和0.86。

表1 標準圖譜庫命中率指數

A頭孢唑啉鈉； B頭孢地尼；C頭孢克肟；D頭孢西丁鈉；E頭孢噻肟鈉；F頭孢曲松鈉；G頭孢呋辛酯；H頭孢呋辛鈉

圖 2 對照品拉曼圖譜

Fig.2 References Raman spectra

2.2 拉曼光譜圖庫驗證

采用概率測試(F-檢測)，用主成分分析對建立的圖庫進行驗證。 在驗證圖庫中采用測試臨界數p值評估，判斷測試樣品是否與拉曼光譜圖庫中的對照圖譜一致。對于鑒定“通過”，p值必須高于(1-閾值)，對于 鑒定“失敗”，p值低于(1- 閾值)。在本實驗的驗證過程中，選擇閾值0.95。隨機抽取樣品來評估評估圖庫專屬性，所有待鑒定的樣本按照圖庫建立的操作程序進行測試。拉曼光譜圖庫驗證滿足兩個條件：1)如果使用正確的樣品來測試光譜圖庫，則“通過”(真陽性)；2)如果使用不正確的樣品來測試光譜圖庫，則“失敗”(真陰性)，見圖3。驗證不同的供應商的原料各選擇20批樣品進行測試。420批樣品驗證HQI矩陣結果見表2。陽性樣品HQI均大于0.98，陰性樣品的HQI均小于0.90。420批樣品驗證鑒定正確率100%。

圖3 拉曼圖庫驗證條件

表2 驗證測試矩陣結果

Table 2 Matrix for validation results

注:P表示鑒定“通過”；F表示鑒定“失敗”

3 討論

在建立拉曼光譜標準圖庫時，為了提高鑒別的正確率，裝對照品容器的材質需和車間取樣鑒別的材質一致，用不同材質的兩種容器(透明的塑料取樣袋和低硼硅玻璃管制注射劑瓶)進行測試,HQI值降低0.01。

在樣品驗證矩陣結果中，對角線(表2 綠色部分)的HQI值應為1.00(或非常接近1.00，若HQI在0.97～0.99之間，在實驗誤差范圍內是可以接受的)。非對角線樣品HQI大于 0.85，鑒別有潛在混淆的風險；HQI在0.85和0.95之間表示混淆的風險是輕微的；若HQI大于0.95，存在重大混淆的風險，需進一步評估鑒別的可行性。企業可以根據驗證的數據，通過風險評估確定合適的命中率指數作為鑒別合格放行標準。

建立的鑒別方法應結合企業實際的取樣規程，確保車間取樣操作流程符合企業文件要求，避免審計缺陷。

4 結論

本試驗建立了手持式拉曼快速鑒別部分頭孢菌素類原料方法，用命中率指數對拉曼光譜圖庫進行評估和驗證，結果表明該方法簡便、準確，可以用于頭孢菌素類企業生產的快速鑒別。