正交設(shè)計優(yōu)選益氣化瘀補腎湯提取工藝

李衛(wèi)先，劉園園

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012)

“益氣化瘀補腎湯”來源于祖?zhèn)黩灧剑幏揭灾嗅t(yī)藥理論為指導(dǎo)，遵循中醫(yī)辨證論治的原則上組方而成，以益氣、活血化瘀、補肝腎的藥物黃芪、當(dāng)歸、海馬等為君藥，佐以三七、杜仲、牛膝、生地、丹參、紅花、續(xù)斷、威靈仙、甘草等補肝腎、利水、行氣活血止痛的藥物，經(jīng)多年臨床使用取得了非常滿意的療效。益氣化瘀補腎湯藥味較多，有效成分種類繁多，目前國內(nèi)對益氣化瘀補腎湯提取工藝尚無研究，檢測單個指標的含量難以反映整體提取效果，本文以干浸膏得率和黃芪甲苷含量為考察指標，以提取次數(shù)、加水量、提取時間為考察因素[1-4]，采用四因素三水平的正交設(shè)計優(yōu)化益氣化瘀補腎湯的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 HPLC高效液相色譜儀；R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DHG-9140A恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海宏都電子科技有限公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)；S205DU電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；98-02-B磁力攪拌電熱套(大連楓洲科技有限公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110781-201717)，益氣化瘀補腎湯組方藥材均由湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬一醫(yī)院提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校李飛艷副教授鑒定，本實驗所用藥材質(zhì)量均符合《中國藥典》(2015年版一部)項下相關(guān)規(guī)定，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，正丁醇(分析純)，氨水(分析純)，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 干浸膏的制備

按處方比例，準確稱取黃芪、三七、當(dāng)歸、杜仲、牛膝、生地、丹參、海馬、紅花、續(xù)斷、威靈仙、甘草等12味藥材，打粉過二號篩，混合均勻，精密稱定，按照正交設(shè)計表提取、過濾，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃鼓風(fēng)干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量[5-6]，計算干浸膏得率，干浸膏得率=干浸膏質(zhì)量/原藥材質(zhì)量x100%。

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(32∶68)為流動相，蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的配制[7]

參照《中國藥典》2015版一部方法，取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備[7～9]

精密稱取組方藥材粉末，按照正交設(shè)計表進行提取，過濾，參照《中國藥典》2015版一部方法，用正丁醇振搖萃取4次，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，棄去氨試液，正丁醇液減壓蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 正交試驗結(jié)果及方差分析

表1 正交設(shè)計試驗法因素水平表

選用提取次數(shù)(A)、加水量(B)和提取時間(C)為考察因素，每個因素取3個水平，以干浸膏得率和黃芪甲苷含量作為考察指標，設(shè)計L9(34)正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交設(shè)計試驗安排表及干浸膏得率

由表2、表3可知，因素B(加水量)和因素C(提取時間)影響比較顯著，且因素B>因素C，因素A(提取次數(shù))影響不顯著；通過極差大小分析，可以得出結(jié)論，影響提取效果的順序為因素B > 因素C > 因素A，即加水量 > 提取時間 > 提取次數(shù)，且B3>B2>B1,C3>C2>C1,A1>A3>A2，因此最佳的提取工藝參數(shù)為A1B3C3，即提取一次，加12倍量蒸餾水，提取60 min。

表3 正交設(shè)計試驗結(jié)果因素間方差分析表

注：方差分析采用LSD法(即最小誤差法)。

2.4 水提工藝的驗證試驗

按處方比例準確稱取藥材100 g，按照正交試驗結(jié)果得出的最優(yōu)提取方式，將A1B3C3重復(fù)進行3次驗證試驗，結(jié)果見表4，結(jié)果干浸膏得率平均值為24.5% (RSD = 1.49%，n= 3)，黃芪甲苷含量為0.0460%(RSD = 1.81%，n= 3)，表明該工藝條件穩(wěn)定、可行。

表4 正交設(shè)計驗證試驗結(jié)果

3 小結(jié)

組方中大部分藥材有效成分均為水溶性成分，本試驗用蒸餾水為溶劑對益氣化瘀補腎湯進行提取，以干浸膏得率為考察指標，該工藝及設(shè)備簡單，經(jīng)濟可行，為益氣化瘀補腎湯的進一步研究和制劑開發(fā)研究提供依據(jù)；組方中黃芪、當(dāng)歸、海馬等為君藥，后續(xù)的開發(fā)研究中，還應(yīng)檢測阿魏酸、綠原酸等多個有效成分的含量，以更好地控制制劑的藥效。