裸鼴鼠抗化學誘癌因素特性的研究

陳 超, 叢 薇, 楊文靜, 崔淑芳

(海軍軍醫大學基礎醫學院實驗動物學教研室, 上海 200433)

裸鼴鼠對癌癥具有天然抗性，無論是野生的裸鼴鼠還是人工飼養的裸鼴鼠，其腫瘤發生率都極低，僅極少數20歲以上的裸鼴鼠發生自發性腫瘤[1]。裸鼴鼠對癌癥的超強免疫力，極有可能為人類攻克癌癥這一醫學難題提供重要線索。此外，其抗腫瘤機制備受關注，甚至一度成為頂尖學術雜志《Nature》的封面主角[2]。因此，對裸鼴鼠生物學特性的研究受到廣泛關注，其抗腫瘤等特性有望為相關疾病的研究和藥物研發提供新的動物模型材料和研究策略[3]。目前，腫瘤已經成為威脅人類健康的第一殺手[4]，而肺癌是發病率、病死率居首的惡性腫瘤，患者總的5年生存率不到15%，在我國則更低[5]。烏拉坦(urethane)又名氨基甲酸乙酯，常用于肺癌疾病動物模型的建立，借助烏拉坦對肺癌的發病機理進行研究及對肺癌治療藥物篩選已成為目前非常重要的研究手段。世界衛生組織下屬國際癌癥研究中心于2007年將其劃分為2A級致癌物。亞胺基偶氮甲苯(OAAT)被廣泛應用于染料制造及醫藥行業，其中的苯環與胺基的氮原子相連接，分子比較活躍，進入人體后會破壞正常細胞中DNA，引起人體病變[6]。同時，OAAT在還原條件下不穩定，會進一步分解成鄰甲苯胺，鄰甲苯胺具有高毒性和致癌性，是環境污染的重要物質[7]。本研究使用以上2種常用的化學致癌劑作為腫瘤誘導劑，分別對裸鼴鼠和常用實驗小鼠進行致病誘導，觀察2組動物的生存及病理變化，可以直觀、系統地觀察裸鼴鼠抗化學藥物致癌的現象，為進一步研究其抗癌機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

52周齡普通級封閉群雄性裸鼴鼠, 由本實驗室自行繁殖飼養(第6世代)； 8周齡SPF級雄性ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠, 購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-016]。動物均飼養在屏障設施[SYXK(滬)2017-0004]。

1.2 主要儀器與試劑

光學顯微鏡購自德國Leica公司； 全自動血液細胞分析儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司； 烏拉坦、OAAT均購自美國Sigma-Aldrich公司,通用型組織固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司,蘇木精、伊紅染液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 烏拉坦對裸鼴鼠的影響 烏拉坦誘導裸鼴鼠組、ICR小鼠組、C57BL/6J小鼠組和BALB/c小鼠組每組各20只，均為雄性。 參照烏拉坦誘導小鼠肺癌模型制備方法，配制10%烏拉坦生理鹽水溶液(10 g/100 mL)[8]。每只動物每次按每克體質量0.01 mL烏拉坦溶液的劑量進行腹腔注射，每周注射2次，持續3個月。每月每組處死4只動物觀察腫瘤發生情況，每月對動物的體質量進行記錄，停藥后每月進行外周血白細胞計數。實驗期間動物若發生死亡則對其進行解剖，觀察肺部情況，并計入每月處死動物數中。誘導結束后2個月，采用安死術處死所有未死亡動物，進行解剖并觀察肺部情況。

1.3.2 OAAT對裸鼴鼠的影響 OAAT誘導裸鼴鼠組、ICR小鼠組、C57BL/6J小鼠組和BALB/c小鼠組每組各10只，均為雄性。將1% OAAT溶液分別涂抹于裸鼴鼠和小鼠兩肩胛間皮膚上(每周對涂藥部位進行一次剃毛)，隔日1次，每次2～3滴。3個月后采用安死術處死動物，觀察胸腺、脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結、骨髓等組織臟器變化情況，并進行組織切片染色觀察。

1.4 數據統計學處理

2 結果

2.1 烏拉坦對裸鼴鼠的影響

小鼠在烏拉坦誘導3個月后開始發生肺腫瘤，誘導結束后2個月肺部腫瘤平均發生率大于50%，而裸鼴鼠在烏拉坦誘導結束后2個月仍然未見腫瘤發生(圖1、表1)； 小鼠平均體質量總體呈下降趨勢，而裸鼴鼠體質量無顯著下降(表2)；小鼠外周血中淋巴細胞、中性粒細胞及單核細胞等白細胞的含量顯著下降，而裸鼴鼠外周血白細胞計數無顯著變化(表3)。

表1 烏拉坦誘導后動物成瘤率

2.2 OAAT對裸鼴鼠的影響

OAAT誘導3個月，病理檢查見小鼠肝竇中橢圓細胞廣泛增生，肝細胞廣泛腫脹，部分肝細胞發生點狀脂肪變性，細胞內充滿小而密的脂滴。胸腺組織中散布有多量吞噬有藍色顆粒狀細胞碎片的巨噬細胞，血管輕度擴張，且充滿紅細胞。紅髓脾竇中大量含鐵血黃素沉積，白髓散布較多吞噬有細胞碎片和含鐵血黃素的巨噬細胞。腸黏膜絨毛固有層有少量漿細胞浸潤。骨髓腔靠近關節位置，造血組織減少、缺失，被脂肪組織取代。裸鼴鼠各個器官組織病理切片未見明顯病變，其中裸鼴鼠的胸腺已基本退化，故病理圖中無裸鼴鼠胸腺染色圖(圖2)。

表2 烏拉坦誘導后動物體質量 g

表3 烏拉坦誘導后動物白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞計數 ×109/L

圖1 烏拉坦誘導結束后2個月不同動物肺臟大體觀察

圖2 OAAT處理動物組織病理學觀察(HE×400)

3 討論

裸鼴鼠本身具有較強的抗腫瘤特性[9]，以裸鼴鼠為模型研究其抗腫瘤機制的報道屢見不鮮。研究[10]發現，裸鼴鼠的成纖維細胞對接觸抑制非常敏感，這種細胞間“早期接觸抑制”能力可有效防止腫瘤細胞的過量增殖。進一步研究[2]發現，裸鼴鼠細胞和組織產生的大量高分子量透明質酸在參與細胞間接觸抑制過程中起到關鍵作用。同時，裸鼴鼠細胞對山中因子(Yamanaka factors)重編程具有很高的抵抗力，誘導多能干細胞(IPCS)克隆率極低，這種現象可以通過失活視網膜母細胞瘤蛋白(Rb蛋白)來逆轉，并且裸鼴鼠IPCS體內畸胎瘤形成率比小鼠低得多，經組蛋白比較，發現裸鼴鼠染色質在啟動子區域具有更緊密得結構，裸鼴鼠細胞具有更穩定的表觀基因組[11]。另外，還有文章[12,13]報道裸鼴鼠特異性單氨基酸變化、高保真蛋白質合成、活躍的抗氧化反應途徑、通過自噬和蛋白質酶體更活躍的蛋白水解均可能有助于裸鼴鼠抗癌性。這些研究報道說明以裸鼴鼠為模型研究其抗腫瘤機制，將為腫瘤的防治提供重要借鑒。本研究通過對裸鼴鼠和常用實驗小鼠進行化學致癌因素誘導的研究，發現裸鼴鼠對于致癌化學因子具有天然的抗性，其生活狀態、生化指標、組織器官的形態與功能都未因外部化學藥物刺激而發生明顯改變。雖然關于裸鼴鼠的類似研究已有報道，但使用的均是模擬野生環境和真社會性生活飼養繁育的裸鼴鼠。本實驗使用的裸鼴鼠為通過實驗動物標準化飼養后生產的裸鼴鼠，本研究結果證明這些裸鼴鼠具有與野生裸鼴鼠同樣天然的、良好的抗腫瘤特性。

同時，免疫系統與機體腫瘤的發生與發展有著密不可分的聯系[14]。在本實驗室前期對裸鼴鼠固有免疫反應的研究中，發現其以巨噬細胞的免疫應答為主[15]。而通過單獨或聯合阻斷整合素相關蛋白(CD47)分子，可以釋放巨噬細胞的抗腫瘤能力[16-19]。這可能是裸鼴鼠對化學致癌因素產生抗性的原因之一。