裸鼴鼠與小鼠抗輻射能力比較研究

陳 超, 叢 薇, 楊文靜, 崔淑芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室, 上海 200433)

1980年代，裸鼴鼠被發(fā)現(xiàn)是一種奇特的真社會(huì)性哺乳動(dòng)物，其終生在離地約2 m的地下洞穴生活，幾乎完全喪失了視覺(jué)，僅依靠身體兩側(cè)的觸須來(lái)辨認(rèn)方向；雖屬哺乳動(dòng)物，卻又類(lèi)似冷血?jiǎng)游锿ㄟ^(guò)與環(huán)境的熱交換來(lái)調(diào)節(jié)體溫。裸鼴鼠擁有長(zhǎng)達(dá)30年以上的壽命，同時(shí)還能在低氧、高二氧化碳濃度的地下環(huán)境中生活，對(duì)癌癥具有超級(jí)免疫力[1-3]。電離輻射廣泛存在于自然界中，具有波長(zhǎng)短、頻率高、能量高等特點(diǎn)，如機(jī)體暴露于輻照條件下，接受照射超過(guò)一定劑量會(huì)導(dǎo)致組織中分子和原子之間的化學(xué)鍵被破壞，從而對(duì)機(jī)體重要的生化結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，造成急慢性輻照損傷、輻照誘變和輻照致癌[4]。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將電離輻射(所有類(lèi)型)列入一類(lèi)致癌物清單。60Co放射源的應(yīng)用非常廣泛，如：輻射育種、食品輻照保藏與保鮮、無(wú)損探傷、輻射消毒、腫瘤的放射治療等。其產(chǎn)生的γ射線能破壞細(xì)胞中的DNA和RNA，使受損的DNA和RNA發(fā)生降解，失去合成蛋白質(zhì)和遺傳功能，從而對(duì)機(jī)體造成損傷[5]。為了探討實(shí)驗(yàn)室馴化的裸鼴鼠對(duì)電離輻射的耐受性，本課題組利用不同劑量和不同照射頻率60Coγ射線分別對(duì)裸鼴鼠和小鼠及兩者的皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行輻照，觀察兩種動(dòng)物的生存及病理變化，直觀、系統(tǒng)地觀察到裸鼴鼠抗電離輻射的現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究其抗電離輻射機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

52周齡雄性裸鼴鼠，由本實(shí)驗(yàn)室自行繁殖(第6世代)飼養(yǎng)； 8周齡雄性ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2013-016]。動(dòng)物均飼養(yǎng)在屏障設(shè)施[SYXK(滬)2017-0004]。裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞按照本實(shí)驗(yàn)室前期方法分離培養(yǎng)[6]。

1.2 主要儀器及試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自新加坡Esco公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；I型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；熒光標(biāo)記流式用抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；小鼠IgG干粉購(gòu)自索萊寶公司；活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物。60Coγ線全身照射由海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 6 Gy一次性全身輻照對(duì)裸鼴鼠的影響60Co γ線6 Gy分別一次性全身照射裸鼴鼠和小鼠，輻照劑量率0.88 Gy/min。輻照后觀察動(dòng)物的大體狀態(tài)。記錄輻照后30 d內(nèi)動(dòng)物的死亡情況，計(jì)算死亡率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)動(dòng)物0 d、2 d、3 d、4 d外周血中的輔助性T淋巴細(xì)胞和殺傷性淋巴細(xì)胞比值(CD4+/CD8+)； 流式細(xì)胞術(shù)每周(0～4 周)檢測(cè)動(dòng)物外周血中的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)百分比。裸鼴鼠組10只；小鼠組ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠各10只，均為雄性。

1.3.2 低劑量多次全身輻照裸鼴鼠的病理觀察60Coγ線1.75 Gy分別全身分次照射裸鼴鼠和小鼠，每周照射1次，共4次，累積劑量為7.0 Gy，輻照劑量率0.88 Gy/min。輻照期間觀察動(dòng)物的大體狀態(tài)。10個(gè)月后安死術(shù)處死動(dòng)物, 觀察胸腺、脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、骨髓等組織臟器變化情況, 并進(jìn)行組織切片觀察。裸鼴鼠組10只；小鼠組ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠各10只，均為雄性。

1.3.3 裸鼴鼠及C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞輻照后的氧損傷測(cè)定 裸鼴鼠與C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞分別接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 每種細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔, 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行60Coγ線輻照, 輻照劑量為6 Gy和50 Gy, 輻照劑量率0.88 Gy/min。輻照后正常培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液, 加入稀釋好的2’, 7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)覆蓋細(xì)胞。DCFH-DA稀釋方法：以1∶1 000的比例用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒中的DCFH-DA，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L。37 ℃體細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，去除DCFH-DA溶液，PBS洗細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞5 min，加入含血清的培養(yǎng)基中和反應(yīng)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s的形式表示，組間差異比較采用ANOVA分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 Gy一次性全身輻照對(duì)裸鼴鼠的影響

6 Gy60Coγ射線一次性輻照活體動(dòng)物，輻照后第3日起，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)飲食和活動(dòng)減少，毛發(fā)蓬松，精神萎靡等狀態(tài)，而裸鼴鼠生命活動(dòng)正常。裸鼴鼠30 d存活率能夠達(dá)到100%, 而小鼠只有30%(圖1A)。通過(guò)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)發(fā)現(xiàn),輻照后2 d的CD4+/CD8+出現(xiàn)明顯升高, 在輻照后4 d升高更為顯著； 小鼠CD4+/CD8+則無(wú)顯著變化(圖1B)。裸鼴鼠輻照后1 d外周血DC細(xì)胞即有明顯升高, 輻照后7 d雖略有回降, 卻仍保持較本底略高的水平, 而14 d裸鼴鼠外周血DC細(xì)胞水平升高近7倍； 小鼠外周血DC細(xì)胞水平變化則相對(duì)較小(圖1C)。所有小鼠組數(shù)據(jù)均為ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠合計(jì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.2 低劑量多次全身輻照裸鼴鼠的病理觀察

少量多次輻照后裸鼴鼠和小鼠飲食和精神狀態(tài)都比較正常。在觀察后期(6個(gè)月后)，部分小鼠開(kāi)始消瘦，毛發(fā)蓬松，不愛(ài)活動(dòng)； 裸鼴鼠無(wú)異常表現(xiàn)。少量多次輻照后小鼠骨組織以骨髓腔內(nèi)紅骨髓(有造血功能)的減少為主要病變；裸鼴鼠的骨組織呈現(xiàn)輕微的纖維化，骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞成分無(wú)異常。小鼠的胸腺、肝脾有不同程度的腫大，腸黏膜上皮大范圍脫落、缺失，腸腔中可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞。裸鼴鼠腸黏膜各級(jí)結(jié)構(gòu)完整，腸上皮細(xì)胞數(shù)量豐富、排列整齊，未見(jiàn)明顯異常。其中裸鼴鼠的胸腺存在比較明顯的退化，故病理圖中無(wú)裸鼴鼠胸腺染色圖(圖2)。

圖2 少量多次輻照后動(dòng)物組織病理學(xué)觀察(HE×400)

圖1 60Coγ射線一次性6 Gy全身輻照對(duì)裸鼴鼠的影響

2.3 輻照后裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞的氧損傷測(cè)定

裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠的皮膚成纖維細(xì)胞在6 Gy劑量輻照24 h后細(xì)胞ROS含量無(wú)顯著變化。而50 Gy劑量輻照24 h后，皮膚成纖維細(xì)胞的ROS含量顯著增加，裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞升高了近5倍，C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞則升高了將近50倍(表1)。

表1 輻照后24 h裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞ROS含量

3 討論

最新研究[7]表明，裸鼴鼠較小鼠有更強(qiáng)的免疫反饋能力，其去除大塊病變的效率是小鼠的2～3倍，去除尿嘧啶的效率是1.5～3倍，切割A(yù)P位點(diǎn)的效率比小鼠細(xì)胞高約1.4倍。CD4+T淋巴細(xì)胞可以激活CD8+T淋巴細(xì)胞，確保建立并維持細(xì)胞毒性作用[8]。CD8+T淋巴細(xì)胞可以抑制抗體合成及T淋巴細(xì)胞增殖過(guò)程，兩者之間存在平衡關(guān)系，也是維持體液免疫與細(xì)胞免疫重要的調(diào)節(jié)者，對(duì)于保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[9]。兩者比值升高提示機(jī)體細(xì)胞免疫處在活躍狀態(tài)，而比值降低則提示機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)[10]。本研究結(jié)果表明，裸鼴鼠在6Gy劑量一次性輻照后，CD4+/CD8+比值顯著升高，而小鼠無(wú)明顯變化，表明裸鼴鼠具有比小鼠更高效的免疫反饋系統(tǒng)，與以往研究結(jié)果一致，這可能是裸鼴鼠抗輻射特性產(chǎn)生的重要原因。

DC是目前已知的最有效的抗原呈遞細(xì)胞和唯一具有激活靜息性T淋巴能力的抗原遞呈細(xì)胞，而其強(qiáng)大的抗原呈遞功能在機(jī)體的免疫應(yīng)答(特別是初次免疫應(yīng)答)中扮演著重要的角色[11]。本研究結(jié)果表明，輻照后裸鼴鼠DC水平明顯升高，而小鼠無(wú)明顯變化，這表明裸鼴鼠擁有比小鼠更高的免疫應(yīng)答水平，這可能也是裸鼴鼠抗輻射特性產(chǎn)生的重要原因。

輻射會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，ROS會(huì)攻擊生物膜上磷脂中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[12,13]。正常皮膚成纖維細(xì)胞中有比較完善的氧化與抗氧化系統(tǒng)，如：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、抗壞血酸、維生素E等，它們可以快速清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，保持細(xì)胞與組織的穩(wěn)定與平衡[14]。本研究分離所得裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞在6 Gy劑量輻照下ROS無(wú)顯著變化，說(shuō)明兩者具有正常皮膚成纖維細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)；在50 Gy劑量輻照下，C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞ROS升高倍數(shù)比裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞ROS升高倍數(shù)更顯著，這說(shuō)明裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞受到的氧損傷比C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細(xì)胞低得多，證明裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞同樣具有卓越的抗輻射特性。

綜上所述，裸鼴鼠在活體水平擁有卓越的抗輻射特性，這可能是由于其擁有良好的免疫應(yīng)答和免疫反饋系統(tǒng)。裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞擁有比小鼠皮膚成纖維細(xì)胞更良好的抗輻射特性。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步研究裸鼴鼠抗電離輻射機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。