斑馬魚甲狀腺腫大病例分析

李英娘, 戴 瑋, 盛 健

(浙江大學醫學院, 杭州 310000)

斑馬魚作為模式生物有其獨特的優勢，如早期胚胎透明，體外受精發育等便于我們實時觀察其發育變化。2018年10月在武漢召開的第四屆全國暨全球華人斑馬魚Principle Investigator(PI)大會有來自不同國家、地區的260多位代表參會。從中看出越來越多的研究學者把斑馬魚作為實驗模式生物。健康的斑馬魚是保證科學研究的基礎，但目前國內缺乏標準化的斑馬魚飼養管理辦法，并且關于斑馬魚疾病的研究也相對較少。

2017年5月份作者所在的斑馬魚實驗室發生了較大規模的斑馬魚甲狀腺腫大現象。甲狀腺腫大在人群中也是一個比較常見的疾病，人類的甲狀腺腫大主要是由于缺碘或者碘過量引起的，中國從1995年開始，強制實行食用鹽加碘，國民的碘營養不良狀況明顯得到改善[1]。碘與甲狀腺炎的發病密切相關[2]。甲狀腺癌是內分泌系統疾病中常見的惡性腫瘤[3]，碘的攝入量不當也會引起該疾病，與適碘地區相比，分化型甲狀腺癌多發生在水源性高碘地區[4]。本文將進一步研究斑馬魚甲狀腺腫大的病因，通過HE染色和透射電子顯微鏡觀察病變組織，同時設計了有碘和無碘飼養組，并分析甲狀腺相關基因的表達差異，為今后該疾病的治療和預防提供一些科學依據及候選模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病魚的特征 病魚來源于浙江大學醫學院斑馬魚平臺，成魚的養殖密度是15～20尾/3 L 的養殖缸，品系是AB。肉眼能觀察到病魚甲狀腺腫大，不同個體腫大程度有差異，但患病的魚能正常游動，正常攝食，也能正常產卵。

1.1.2 儀器和試劑 斑馬魚養殖單元(上海海圣生物技術有限公司)，全自動樣品快速研磨儀(上海凈信科技公司), 體視熒光顯微鏡(Nikon SMZ18)，正置熒光顯微鏡(Nikon ni)，熒光定量PCR儀(羅氏 480II)，透射電子顯微鏡(FEI tecnai 10)。

SYBR Premix和提取RNA的試劑盒(南京諾唯贊生物公司)，豐年蟲卵(天津豐年水產養殖有限公司)，海鹽(浙江藍海星鹽制品有限公司)，片狀混合飼料(廣東江門海豚飼料)，其他試劑均由國藥生產。

圖1 甲狀腺腫大病魚

1.2 飼養條件

斑馬魚的養殖系統水都是經過去離子純水儀處理的自來水。養殖系統里會自動加入適量的分析純氯化鈉和分析純碳酸氫鈉, 系統的pH值7.2～7.4, 電導率 485～510 μs/cm, 水溫 28～29 ℃，光暗時間： 14 h∶10 h。每日早晚飼喂孵化好的豐年蟲2次，孵化豐年蟲使用分析純氯化鈉和分析純碳酸氫鈉。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色 固定組織： 先用1 mg/mL Tricaine溶液將患有甲狀腺腫大的斑馬魚麻醉猝死, 隨后整條魚放入10 mL的體積分數10%甲醛溶液固定7 d。再通過包埋、切片、染色。HE染色可以將細胞核染為紫藍色, 細胞質和細胞外基質染為紅色。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察 冷凍猝死患病斑馬魚, 在顯微鏡下取下突起的紅色病變組織(甲狀腺),用1 mL 體積分數2.5%戊二醛PBS緩沖液4 ℃固定超過1個月。再通過包埋、超薄切片、染色。

1.3.3 檢測使用分析純氯化鈉和海鹽養殖水內碘含量 分別收集使用分析純氯化鈉養殖的循環水500 mL，和海鹽養殖的循環水500 mL。收好的樣品放在-20 ℃貯存。樣品送青島斯八達分析測試有限公司檢測，檢測水體里碘元素的濃度。

1.3.4 有碘和無碘飼養 有碘組養殖水：直接從海圣循環養殖單元中取出，養殖單元中系統自動加入適量的海鹽和碳酸氫鈉，電導率控制在490～510 μs/cm，pH 值控制在7.2～7.4。

無碘組養殖水： 10 L的純水(分析純氯化鈉35 g、碳酸氫鈉2 g、氯化鈣 1 g、氯化鉀0.5 g)。

1.3.5 熒光定量PCR法檢測基因表達差異

1.3.5.1 提取RNA 每個實驗組設置3個重復，隨機挑選受精后7 d (7dpf) 50尾作為一組，挑選60 dpf 的5尾作為一組。先加入1 mg/mL Tricaine將魚猝死，隨后加入裂解液,并用全自動樣品快速研磨儀震動40 s使斑馬魚組織完全裂解，然后用試劑盒提取RNA。

1.3.5.2 甲狀腺相關基因的表達 具體檢測基因及序列如表1。

2 結果

2.1 斑馬魚甲狀腺組織HE染色

正常情況下斑馬魚的甲狀腺組織是彌散分布的，圖中空泡較大的區域都是甲狀腺。如圖2所示甲狀腺(A)彌散分布在斑馬魚頭部,并且可以觀察到甲狀腺濾泡(D)腫大的現象。

2.2 透射電子顯微鏡鏡觀察

正常核仁比較圓潤，正常線粒體內部分布了很多的線粒體嵴。患有甲狀腺腫大的病魚，其核仁形態異常，線粒體腫大且自溶，細胞已經有調亡的趨勢，如圖3所示。

2.3 分別檢測使用分析純氯化鈉和海鹽的養殖水內碘含量

使用分析純氯化鈉養殖的循環水碘的濃度小于方法檢出限, 海鹽養殖的循環水碘濃度為7.87 μg/L。

表1 甲狀腺素相關基因引物序列[5]Table 1 Primer sequences for thyroid hormone gene

圖2 斑馬魚甲狀腺組織HE染色觀察圖

圖3 斑馬魚甲狀腺組織透射電子顯微鏡觀察

2.4 甲狀腺相關基因的Ct值

兩種飼養條件下飼養7 dpf的小魚對比，檢測的5個基因，只有CRF基因表達有差異，無碘組表達量低于有碘組(P＜0.05)。兩種飼養條件下，60 dpf的小魚對比，5個基因的表達都無差異。同一飼養條件下，不同日齡小魚的基因表達量有差異，詳見表2。

3 討論

3.1 CRF、TSHβ、NIS、TG、TPO基因相對表達量的差異

CRF能調節甲狀腺激素的合成。促甲狀腺素β(TSHβ)是一種垂體激素, 能促進甲狀腺合成甲狀腺素(T4)[6]。鈉碘同向轉運體(NIS)可以將碘轉運到甲狀腺濾泡細胞里面[7,8]。甲狀腺球蛋白(TG)的數量能直接反應甲狀腺功能是否正常。甲狀腺過氧化物酶(TPO)是甲狀腺激素合成的一種酶, 可以將碘化離子氧化成碘[9]。本實驗無碘條件下飼養7 dpf斑馬魚,CRF基因的表達量明顯低于有碘組,CRF的表達量降低會引起促甲狀腺激素分泌減少，表明碘對CRF基因的表達可能有調控作用。

表2 比較CRF、TSHβ、NIS、TG、TPO相對表達量的Ct值和P值

3.2 線粒體腫大和甲狀腺腫大的關系

線粒體腫大在很多疾病中常被提到，過量的服用鐵和大量的飲用酒精都會導致線粒體腫大[10],注射內毒素也會觀察到肝臟線粒體腫大[11]。線粒體功能的異常也會導致很多的疾病，例如耳聾、心臟病、帕金森病、癌癥等[19]。當機體細胞損傷時線粒體腫大是比較常發生的，腫大的線粒體會出現線粒體基質變淺，有些嵴甚至消失。內共生假說認為，線粒體的形成是原核細胞吞噬了好氧細菌，兩者經過長時間的互作關系，形成一個共生體[12]。本實驗室甲狀腺腫大的斑馬魚數量逐漸增多以后，通過調整飼養條件，一個月后甲狀腺腫大大部分都消失，在斑馬魚身上的甲狀腺腫大是可逆的。線粒體相比于其他的細胞器，是一個比較獨立的細胞器，當機體內發生不利于線粒體生存的條件時，它們能快速做出響應。線粒體腫大和甲狀腺腫大是如何發生的，它們之間存在什么關聯，有待進一步研究。

3.3 緩解斑馬魚甲狀腺腫大的方法

首先把養殖系統里使用的分析純氯化鈉換成海鹽，海鹽里含有多種微量元素更加有利于斑馬魚的健康。發病前斑馬魚養殖水體的溫度是28～29 ℃； 發病以后我們將溫度調低, 水溫控制在26～27 ℃。發病前每日是投喂2餐孵化好的豐年蟲, 發病以后改為1餐豐年蟲, 1餐片狀混合飼料。

3.4 人類甲狀腺腫大的模型價值

缺碘或者碘攝入過多都會引起甲狀腺疾病，缺碘情況下甲狀腺激素的合成不足，促甲狀腺激素會增多，會導致甲狀腺上皮細胞的過度增生，表現為甲狀腺腫大[12,13]。甲狀腺腫大是一種對慢性碘缺乏癥的生理適應[14]。斑馬魚缺碘出現甲狀腺腫大與人類缺碘引起的“大脖子病”有同樣的機制及表型，是人類大脖子病的潛在模型。

3.5 推行標準化斑馬魚飼養管理制度

2013年第一部實驗用魚質量控制標準(DB11 /T 1053-2013)包括了：養殖水中微生物學等級及監測[15]、養殖水中寄生蟲學等級及監測、遺傳質量控制[16]、配合飼料技術要求、飼養環境條件和病理診斷規范”六個部分。但標準中未涉及到碘含量，而根據本實驗結果，缺乏碘會導致斑馬魚甲狀腺腫大，威脅到斑馬魚健康，所以在飼養斑馬魚時需使用有碘鹽，以保證斑馬魚健康。

(感謝洪曉黎、張璐文、王貝貝、謝恩軍、劉麗、何旭艷、尹文林、潘魯湲等在課題開展過程中給予的指導和幫助。)