應用FISH-AFLP技術分析105份櫻桃種質資源的親緣關系

陳新　徐麗　宗曉娟　王甲威　譚鉞　朱東姿　魏海蓉　洪坡　劉慶忠

摘要：為建立櫻桃種質資源的FISH-AFLP技術體系并進行親緣關系分析，本研究以國內外搜集的105份櫻桃種質為對象，經DNA提取、EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，再進行FISH-AFLP反應。擴增結果顯示，篩選得到8對EcoRⅠ/MseⅠ多態性引物，可擴增出1 148條譜帶，平均多態性比率98.61%。聚類分析和遺傳多樣性分析結果顯示，105份櫻桃栽培品種的遺傳相似性系數為0.54～0.89，當閾值為0.68時，可分成7個AFLP群;有效等位基因數、基因多樣度、Shannon信息指數分別為1.52、0.30、0.45，具有較高的遺傳多樣性。本研究結果可為今后櫻桃品種鑒別和遺傳多樣性研究等提供理論指導。

關鍵詞：櫻桃;FISH-AFLP;遺傳多樣性;親緣關系

中圖分類號：S662.5文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0022-06

Genetic Relationship Analysis of 105 Accessions of

Cherry Germplasms by FISH-AFLP Technology

Chen Xin， Xu Li， Zong Xiaojuan， Wang Jiawei， Tan Yue，

Zhu Dongzi， Wei Hairong， Hong Po， Liu Qingzhong

（Shandong Institute of Pomology/Shandong Provincial Key Laboratory of

Fruit Tree Biotechnology Breeding， Taian 271000， China）

Abstract The objective of this study was to establish FISH-AFLP analysis system for cherry and analyze the genetic relationship of the main cultivars. One hundred and five cherry cultivars were selected as experiment materials. The high-quality genomic DNA was extracted and the purified DNA samples were digested with EcoRⅠ/MseⅠ;after ligation reaction， the samples were used to perform FISH-AFLP detection. The amplification results showed that eight pairs of EcoRⅠ/MseⅠ polymorphic primers were screened and 1 148 bands were obtained. The average percentage of polymorphic bands was 98.61%. The results of cluster analysis and genetic diversity analysis showed that the genetic similarity coefficient of the 105 cherry cultivars varied from 0.54 to 0.89. All the samples were divided into 7 groups when the threshold value was 0.68. The numbers of effective alleles， gene diversity and Shannon information index of the main cultivars were 1.52， 0.30 and 0.45， respectively， indicating high genetic diversity. This study could provide theoretical guidance for the identification and genetic diversity research of cherry varieties in the future.

Keywords Cherry; FISH-AFLP; Genetic diversity; Genetic relationship

櫻桃為多年生木本果樹，屬薔薇科櫻桃屬。目前世界上作為果樹栽培的櫻桃有4個種，品種繁多，僅栽培品種就超過2 000個。隨著我國新品種的不斷選育以及國外品種的引進，基于表型性狀標記鑒定不同品種以及確定品種分類地位及相互之間的親緣關系越來越困難。DNA分子標記在櫻桃上的應用已有報道。其中，RAPD[1-3]、SSR[4，5]皆曾用于櫻桃種質資源的研究，但揭示的多態性位點較少;國外研究者曾利用cpSCAR分析櫻桃品種間的遺傳關系和多樣性[6]，但多集中在親緣關系較近的歐洲甜櫻桃品種上，尤其是一些老品種。

AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性）檢測DNA多態性的方法，于1995年以論文形式發表[7]，是通過限制性內切酶片段的不同長度檢測DNA多態性的一種DNA分子標記技術。AFLP具有多態性強、譜帶豐富和靈敏、分辨率高、快速高效、重復性好等特點，是一種較為理想的分子標記技術[8]，可用于檢測種及種以下水平上的差異。目前，科研人員已利用AFLP技術進行遺傳連鎖圖譜構建、抗病連鎖基因分析和品種親緣關系等研究[9-11]。而帶有熒光標記的FISH-AFLP技術在各種生物的遺傳多樣性分析、分子鑒定和群體遺傳結構等研究中也得到廣泛應用[12-17]，但該技術應用于櫻桃資源的研究未見報道。基于此，本試驗利用FISH-AFLP技術標記對櫻桃種質進行研究，并對遺傳多樣性的重要度量指標——有效等位基因數（Ne）、基因多樣度（H）及Shannon信息指數（I）進行分析，旨在建立櫻桃種質FISH-AFLP分子標記的方法，并為品種鑒別、親緣關系劃分和遺傳多樣性研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品為105份櫻桃種質資源（表1），均種植于山東省果樹研究所櫻桃品種資源圃。于2018年4月采集樹體中上部新鮮嫩葉，置于冰盒帶回實驗室，-80℃保存備用。

1.2 櫻桃基因組DNA制備及酶切反應

采用改良CTAB法[18]提取葉片基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。

酶切和連接反應在同一反應中進行。總體系20 μL：10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL、AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL、EcoRⅠ/MseⅠAdaptor（10 μmol/L） 各1 μL、模板DNA 5 μL，補ddH2O至20 μL。混勻離心數秒，25℃保溫5 h。

1.3 AFLP分析

利用編號為4、25、26和91的樣本，從64對AFLP EcoRⅠ/MseⅠ引物中篩選出擴增圖譜清晰的8對引物：E41M56、E49M62、E44M58、E33M84、E59M72、E33M48、E38M86和E40M48（表2）。

預擴增反應總體系為20 μL，其中包括酶切-連接模板DNA 4 μL，2×PCR Mix 10 μL，EcoR Ⅰ和MseⅠ引物（20 μmol/L）各1 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環; 72℃ 5 min;4℃保存。預擴產物稀釋20倍作為選擴模板，選擇性擴增總體系20 μL，其中包括預擴增稀釋樣品 2 μL，2×PCR Mix 10 μL，EcoRⅠ和5′端帶有熒光標記的MseⅠ引物（20 μmol/L，表2）各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應程序為：95℃ 5 min;95℃ 35 s，65℃ 35 s，72℃ 1 min，每個循環退火溫度遞減0.7℃，擴增12輪; 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個循環;72℃ 5 min;4℃保存。

將甲酰胺與分子量內標按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板，再加入1 μL稀釋10倍的上述PCR產物。使用3730XL測序儀進行毛細管電泳。

1.4 數據統計與分析

利用GeneMarker 1.8 軟件將測序儀得到的原始數據進行分析，將電泳圖轉化為0/1數據矩陣，即有帶記為1，無帶記為0;用軟件NTSYS-pc 2.11對所得數據矩陣進行聚類分析，生成聚類圖;用軟件Popgene 1.32計算樣品遺傳多樣性的度量指標——有效等位基因數（Ne）、基因多樣度（H）及 Shannon 信息指數（I）。

2 結果與分析

2.1 不同引物組合 FISH-AFLP 擴增的多態性比較[HTSS]

由表3可以看出，8對引物共擴增得到1 148條譜帶，平均每對引物產生143.5條譜帶，多態性譜帶1 132條，平均多態性比率98.61%。不同引物組合在擴增帶數、帶型、條帶分布均勻度等方面皆有所差異。其中，引物組合E33M84和 E41M56多態性比例達到100%，其它引物組合的多態性比例也在95%以上。圖1為引物組合E40M48對所有樣品的擴增結果。

2.2 105份櫻桃種質資源的親緣關系

2.2.1 遺傳相似性系數 [HTSS]105份櫻桃種質資源的遺傳相似性系數為0.54～0.89，平均值為0.72。其中桑緹娜和Stella的遺傳相似性系數最大，為0.89，親緣關系較近;哥倫比亞和毛櫻桃2號以及尤巨和M16之間的遺傳相似性系數最小，均為0.54，表明品種間的親緣關系較遠。

2.2.2 聚類分析 [HTSS]在相似系數0.68處做結合線，該線將試驗樣品分成7個AFLP群（AFLP Groups，簡稱 AG）：AG1含有1個品種，即灰毛葉櫻桃;AG2含有3個品種，即大青葉、泰山紅櫻和泰山干櫻;AG3含有1個品種，即東北紅櫻; AG4含有5個品種，即多毛櫻桃、馬哈利×草原櫻桃、馬哈利實生后代、M16和奧德; AG5含有17個品種，即六倍體（吉塞拉）、B5、六倍體實生、草原櫻桃、美麗、SC1、ZY-1、SC6、SC4、早生、SDL-1、聶美人、colt、東塘、短枝櫻桃、F8和艾雜; AG6含有1個品種，即毛櫻桃2號;AG7中含有其它77個品種。

2.2.3 遺傳多樣性分析 [HTSS]根據數據矩陣計算不同引物組合的遺傳多樣性度量指標（表4），進行遺傳多樣性分析。8對引物檢測到樣品不同位點的有效等位基因數為1.43～1.57，平均為1.52;基因多樣度為0.26～0.32，平均為0.30;Shannon信息指數為0.39～0.48，平均為0.45。

3 討論與結論

本試驗采用FISH-AFLP方法，對105個櫻桃種質資源進行多樣性分析，選用的8對引物組合共產生1 148條譜帶，平均每對引物產生143.5條譜帶，其中，多態性譜帶1 132條，多態性位點數高達98.61%。該方法得到的譜帶數與其它樹種FISH-AFLP所獲數值相近[19，20]，高于普通銀染AFLP所獲譜帶數[17-21]。由此可見，作為一種新型的分子標記，FISH-AFLP技術在櫻桃資源的系統分類、親緣關系鑒定、品種鑒別、親本選擇等方面具有潛在的應用前景。本試驗確立的FISH-AFLP體系、篩選的引物組合及所得親緣關系和遺傳多樣性等數據均可為后續相關研究提供參考，對其它物種的AFLP研究也有一定的參考價值。

本研究通過聚類分析發現，蘇1號、泰山紅日和泰山朝陽櫻桃品種聚在一亞類，體現了它們較近的親緣關系，說明具有相同的遺傳背景。這與三者是從那翁為母本、大紫為父本雜交產生的實生群體中選育出的優良品種的事實相符合。另外，吉塞拉6號和吉塞拉7號是灰毛葉櫻桃和酸櫻桃雜交育成的優良櫻桃砧木，具有矮化、抗性強、嫁接親和性好等特點。Y1是從吉塞拉6號自然受粉獲得的種子后代中篩選出的四倍體新種質，Y1和吉塞拉6號親緣關系較近，優先聚在一起，然后再與吉塞拉7號聚集。

評價群體遺傳多樣性水平的重要指標包括有效等位基因數（Ne）、基因多樣度（H）和Shannon指數（I）。本研究得到的遺傳多樣性參數為Ne=1.52，H=0.30，I=0.45。本試驗對櫻桃主栽品種進行研究，其遺傳相似系數為0.54～0.89，平均為0.72。由于研究樣品中既有歐洲引進的甜櫻桃（Prunus avium L.）品種，又有酸櫻桃（P. cerasus L.）、中國櫻桃（P. pseudocerasus LindI.）、雜交品種和野生櫻桃屬植物，所處環境和地域較廣，而櫻桃的種植年限長，遺傳背景豐富，因此遺傳相似系數閾值范圍比較大。

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收稿日期：2019-06-10

基金項目：山東省農業科學院青年科研基金項目（2016YQN25）;山東省現代農業產業技術體系果品創新團隊項目（SDAIT-06-04） ;科技部科技基礎平臺項目（NICGR2018-048）

作者簡介：陳新（1980—），男，博士，副研究員，主要從事果樹種質資源與分子生物學研究。E-mail： sdaucx@163.com

通訊作者：劉慶忠（1963—），男，博士，研究員，研究方向：果樹種質資源與生物技術育種。E-mail： qzliu001@126.com

徐麗（1983—），女，博士，助理研究員，主要從事果樹種質資源和分子生物學研究。E-mail： xuli1245@ 163.com