食用菌ACE抑制肽制備及其功能活性研究進展

許新月　崔文玉　柏雨岑　王文亮　楊正友　王延圣

摘要：高血壓疾病嚴重危害人類健康，ACE抑制肽易被人體吸收且降血壓效果好，現正逐漸應用于該類疾病的調控。我國食用菌資源豐富、種植量大，其中提取得到的ACE抑制肽毒副作用小、安全性高，現已成為重要研究熱點領域。本研究從食用菌ACE抑制肽的作用機制、提取與分離鑒定、活性檢測以及構效關系等方面進行綜述，以期為進一步開展研究奠定基礎。

關鍵詞：食用菌;ACE抑制肽;高血壓;制備;功能活性

中圖分類號：S646.099文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0157-05

Research Progress of Preparation and Functional Activity of

ACE Inhibitory Peptides from Edible Fungi

Xu Xinyue1， Cui Wenyu1， Bai Yucen2， Wang Wenliang1， Yang Zhengyou3， Wang Yansheng1

（1. Institute of Agro-Food Science and Technology， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，China;

2. China Rural Technology Development Center， Bejing 100048， China;

3. College of Life Sciences， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract Hypertensive diseases is a serious hazard to human health. ACE inhibitory peptides can be easily absorbed by human body and have a good blood pressure lowering effect， which gradually being applied to the regulation of such diseases. Chinas edible fungi are rich in resources and large in planting amount， from which， the extracted ACE inhibitory peptide was small toxic and side effects and high safety， so it has become an important research hotspot. In this study， the action mechanism， extraction and isolation， activity detection and structure-activity relationship of edible ACE inhibitory peptides were reviewed in order to lay foundations for further research.

Keywords Edible fungus; ACE inhibitory peptide; Hypertension; Preparation; Functional activity

全球十大死亡原因中頭號死亡殺手為心血管疾病。中國心血管患病人數約2.9億，其中高血壓患者占比最大，且年輕化趨勢明顯[1]。高血壓疾病的發病因素不同，但原發性高血壓可以借助食物中的某些蛋白質及多肽來進行調控。食物中能起到降血壓作用的蛋白質及多肽被稱為血管緊張素轉換酶（ACE抑制肽）[2]。ACE通過將血管緊張素Ⅰ轉換為血管緊張素Ⅱ引起血管收縮，進而使血壓升高，ACE抑制肽就是通過抑制血管緊張素的轉換過程來降低血壓[3]。

我國食用菌產量連年增長，種類繁多，資源豐富。近年的研究發現，食用菌中的功能活性成分可對人體健康產生積極影響，特別是在降血壓、抗氧化等方面表現突出。目前，科研人員已證實該活性成分為ACE抑制肽，并對多種食用菌中該物質含量、功效以及提取方法進行了研究[4]。本研究從食用菌源ACE抑制肽的作用機制、制備工藝、活性檢測以及構效關系等方面進行綜述，以期為進一步研究和開發該物質提供參考。

1 ACE抑制肽的作用機制

生物體的血壓調節機制從腎素-血管緊張素系統（RAS）中的血管緊張素元開始。血管緊張素元在腎素的作用下轉化成血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉換酶（ACE）的作用下轉化成血管緊張素Ⅱ進而引起血管收縮，同時引起醛固酮的釋放，作用于遠曲小管和集合管，使其增加對Na+和水的吸收，引起血壓升高[5]。在激肽釋放酶-激肽系統（KKS）中，激肽原在激肽釋放酶的作用下轉化成激肽，而激肽在ACE的作用下轉化成無活性片段使血管收縮、血壓升高，而 ACE抑制肽能夠將形成的激肽轉變成緩激肽進而降低血壓[6]。

2 食用菌ACE抑制肽的提取與分離鑒定

2.1 提取方法

2.1.1 水提法 該法是提取食用菌中ACE抑制肽的常用方法[7-11]。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質或肽類穩定性好，溶解度大。用水提法提取ACE抑制肽時，應注意控制料水比、pH值和溫度等因素，從而顯著提高得率[10，11]。研究者多以大白口蘑[7]、蟹味菇[8]、茶樹菇[9，10]、靈芝[11]等栽培食用菌和灰樹花、雙色牛肝菌等野生食用菌為原料，采用水提法得到ACE抑制肽粗提物后進行分離提純，所得ACE抑制肽提取率較高，降血壓效果理想。

2.1.2 硫酸水解法 該法屬于酸水解法的一種，是利用不同樣品中蛋白質等電點的不同，通過使用硫酸等試劑將樣品溶液調至所需蛋白的等電點附近形成沉淀后析出的方法[11，12]。Zhang等[13]以五種蘑菇為原料，采用硫酸水解法制備ACE抑制肽，發現平菇水解物對ACE的抑制效果最好（IC50=64.11 mg/mL）;采用四步純化法純化出的ACE抑制肽均表現出良好的抗熱、抗酸堿和易于體外消化的特性。

2.1.3 硫酸銨沉淀法 多肽在高濃度鹽存在時發生凝聚并析出沉淀，使用高濃度的硫酸銨鹽提取ACE抑制肽時，將pH值控制在一定范圍內可提高提取率，并通過超濾等操作來分離純化出ACE抑制肽[14]。Ansor等[15]使用硫酸銨沉淀法制備靈芝中的ACE抑制肽，將沉淀得到的粗蛋白進行反向液相色譜（RP-HPLC）分離ACE抑制肽并檢測其活性，結果顯示ACE抑制肽抑制率IC50值為1.13 mg/mL。

2.1.4 甲醇提取法 該法屬于有機溶劑提取法的一種，可使樣品中ACE抑制肽溶解度降低，形成沉淀后析出[16]。Jang等[17]以側耳菌為原料，以甲醇提取法提取ACE抑制肽，在經過超濾、Sephadex G-25柱層析、連續C18和SCX固相萃取以及反相HPLC純化后，得到兩種純化的ACE抑制肽，同時對ACE抑制肽的抗血壓活性進行了研究，IC50值分別為0.46、1.14 mg/mL，分子量分別為1 622.85、2 037.26 Da，在原發性高血壓小鼠體內表現出顯著的降血壓功效。

2.2 ACE抑制肽的分離鑒定

在進行ACE抑制肽的分離純化時，通常采用超濾法、凝膠層析法以及高效液相色譜法聯用的方式。超濾法是利用超濾膜的孔隙，將不同分子量的物質進行分離[18]。凝膠層析法是利用凝膠顆粒小孔吸附分子質量不同的物質，質量小于凝膠顆粒小孔的被吸附，分子質量大的物質先被洗脫出來，被凝膠吸附的物質后被洗脫，樣品得到進一步分離[19]。高效液相色譜法是根據分離物質的疏水性不同，各組分之間相互影響進而能夠在分離柱中得到分離[20]。Hatanaka等[21]將兩種方法聯用，即凝膠層析后的樣品進行高效液相色譜分離，對不同峰值的樣品收集后進行純化，得到活性最強的一組分離肽。Geng等[5]在研究松茸和三色雷蘑ACE抑制肽的分離純化時，先將松茸樣品分別使用5 kDa和10 kDa的濾膜進行過濾，再進行ACE抑制率的檢測，檢測結果顯示經過5 kDa過濾后的樣品表現出更好的ACE抑制活性，并將過濾后的樣品先后通過Mono-Q陰離子交換柱層柱和Superdex peptide凝膠過濾層析，得到的樣品與標準蛋白樣品進行比對，發現ACE抑制肽的相對分子質量大約是800 Da。

LC-MS/MS是鑒定ACE抑制肽常用的方法之一。Lau等[22]利用該方法鑒定了從不同食用菌中提取得到的8種功能較強的ACE抑制肽，經與其它食用菌中分離的ACE抑制肽對比，發現序列為AHEPVK、RIGLF和PSSNK的肽具有較低的IC50值，分別為63、116、29 mg/mL;序列為AHEPVK和RIGLF的肽是ACE競爭性抑制劑;序列為PSSNK的肽是非競爭性抑制劑，在消化后表現出較高的ACE抑制活性，可以作為生產抗高血壓補充劑的理想成分。

3 ACE抑制肽活性檢測方法

3.1 體外檢測

Cushman等[23]建立的紫外分光光度法是最早也是最廣泛使用的ACE抑制肽活性的體外檢測方法。它的工作原理是利用血管緊張素Ⅰ的模擬物馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）與ACE反應生成馬尿酸（血管緊張素Ⅱ的模擬物），后加入ACE抑制肽（可減少馬尿酸生成量），加入前、后分別使用紫外分光光度計測定馬尿酸生成量，對比分析得出ACE抑制肽的抑制活性。但在實際操作中，使用紫外分光光度計法檢測ACE抑制活性，會出現不是因為ACE作用生成的馬尿酸，這樣多出來的馬尿酸會對試驗結果產生影響。

高效液相色譜法[24]是在紫外分光光度法的基礎上將HHL與馬尿酸分離后再進行紫外分光光度檢測。選擇高效液相色譜分離后的產物再進行紫外分光光度法檢測，相對減少試驗誤差，精確度較高，結果更準確。趙元暉等[25]在該方法的基礎上進行改良，進一步減少了馬尿酸在紫外228 nm處的檢測誤差，提高了精確度。

可見光分光光度計法原理為血管緊張素Ⅰ模擬物呋喃丙烯酰三肽（FAPhe-Gly-Gly），在ACE的作用下轉化為血管緊張素Ⅱ模擬物氨基酸（FA-Phe，FAP）和二肽（Gly-Gly，GG）。在該過程中加入ACE抑制肽能夠抑制血管緊張素Ⅰ模擬物向血管緊張素Ⅱ模擬物的轉換，再利用分光光度計檢測生成的血管緊張素Ⅱ模擬物的含量來確定ACE活性，依次來推斷出ACE抑制肽的抑制率[26]。

何海倫等[27]借助毛細管電泳法簡化了傳統試驗中需要多次進行分光光度計測量的情況，僅需在馬尿酸與ACE反應完全后，將樣品加入到毛細管中進行電泳分析就可得到試驗結果，該試驗方法方便快捷。

建議多種檢測方法并用，從而盡可能減小不同檢測方法可能帶來的誤差。

3.2 體內活性檢測

ACE抑制肽的體內活性檢測方法通常使用動物進行活體試驗。模型動物一般為原發性或是繼發性高血壓大鼠。原發性高血壓模型是以原發性高血壓大鼠為試驗對象，檢測給藥前后大鼠血壓的變化來推斷ACE抑制肽的活性[28]。繼發性高血壓模型是以人為手段造成高血壓癥狀的大鼠為試驗對象進行短期或長期的觀察，給藥的方式也分為短期的一次性或者是長期的每天或每周的連續給藥[29]。

4 ACE抑制肽功效特性及構象關系

ACE抑制肽通常具有2～12個氨基酸的短鏈肽。晶體學研究表明任何肽都不能與ACE的活性位點結合。在某些情況下，長鏈肽具有ACE抑制活性，而氨基酸的類型可能比肽的長度更重要，這與氨基酸組成有關。當肽鏈中含有高酸性氨基酸（Asp和Glu）時，肽鏈顯示凈負電荷，能夠與鋅原子結合[30]。與鋅原子結合后的肽鏈具有抑制活性，參與哺乳動物的血壓調節，分布在哺乳動物身體各處。ACE抑制肽的C末端或N末端具有特定的氨基酸殘基，其中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和精氨酸的存在對ACE結合影響很大[31]，C末端具有正電荷的氨基酸也影響肽的抑制作用[32]。

4.1 分子質量的影響

ACE抑制肽的分子質量與抑制效果具有一定相關性。研究人員發現，肽鏈較短的ACE抑制肽較肽鏈長的ACE抑制肽有更好的抑制效果[33]。王晶晶[34]發現分子質量小于3 kDa的抑制肽抑制效果最好，大于10 kDa的抑制效果較差。徐克寒等[35]發現ACE抑制肽中分子質量小于1 kDa的抑制肽抑制效果最好。

4.2 氨基酸序列的影響

20世紀70年代，Ondetti等[36]發現ACE抑制肽C端的幾個氨基酸對ACE抑制肽的抑制效果有重大影響。當ACE抑制肽的一級氨基酸中大量存在疏水氨基酸，同時C端帶有正電荷的氨基酸、N端含有芳香族氨基酸時，ACE抑制肽的抑制活性較高。

4.3 ACE抑制肽結構與抑制率的關系

Liu 等[37]和Pan 等[38]使用模擬分子對接的方法對ACE抑制肽的構效關系進行了研究，發現處在ACE抑制肽中心的氨基酸對ACE抑制肽的效果有重要影響，ACE與ACE抑制肽結合產生作用的位點也不相同。此外，彭劍秋等[39]還利用定量構效關系（quantitative structure activity relationship，QSAR）來進行ACE抑制肽構效關系的研究，進一步補充了抑制肽構效關系。

5 ACE抑制肽研究展望

食用菌源的ACE抑制肽，因其原料易得且降血壓效果好正逐漸被大眾接受。在相關研究中，ACE抑制肽的具體降血壓機制受到多方面的影響，包括ACE抑制肽的來源、提取方式以及活性多肽的結構等。近年來越來越多的研究，使得我們對于食用菌ACE抑制肽有了更加詳細的了解，但對于它的具體作用機制尚不明確，仍需進行更加深入的探究。

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收稿日期：2019-07-03

基金項目：山東省自然科學基金（三院聯合基金）項目（ZR2016YL029）;山東省農業科學院青年科研基金項目（2016YQN48）;山東省食用菌創新團隊產后加工崗位專家項目（SDAIT-07-08）

作者簡介：許新月（1995—），女，碩士研究生，研究方向：農產品采后保鮮與加工。E-mail：xuxinyue2018@163.com

通訊作者：王延圣（1988—），男，博士，助理研究員，研究方向：農產品采后保鮮與加工。E-mail：sdnky_wys@163.com