芒果MinSPP基因的克隆及表達載體構建

白蓓蓓 荊永琳 蔡秉宇 藍麗 李倩 趙志常 陳業淵

摘要：磷酸蔗糖磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase）是合成蔗糖的關鍵酶，為了研究其在芒果果實中蔗糖合成的作用機制，從芒果果肉中克隆得到1個與蔗糖合成相關的基因，將其命名為MinSPP，其cDNA全長序列為1 561 bp，開放閱讀框為1 275 bp，編碼424個氨基酸，蛋白質分子量為48.46 ku，等電點為5.34，對MinSPP基因編碼的蛋白進行系統發育分析，發現其與克萊門柚具有較近的親緣關系。采用qRT-PCR對該基因在后熟處理的貴妃芒果肉中的表達量進行分析，結果顯示從青熟期到成熟期芒果果肉中該基因表達量逐漸上升，從成熟期到完熟期芒果果肉表達量逐漸降低，其中成熟期芒果果肉中表達量較高。本研究深入了解了芒果蔗糖合成的分子機制，進一步構建了pBI121-MinSPP過表達載體，為MinSPP的功能鑒定奠定了理論基礎。

關鍵詞：芒果;MinSPP基因;分子機制;蔗糖合成;甜度;克隆;表達載體構建

中圖分類號： S667.701?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0103-05

在高等植物中蔗糖是光合作用的產物，在植物的生長、發育、儲存、信號轉導等方面具有運輸糖的核心作用[1-2]。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，簡稱SPS）和磷酸蔗糖磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase，簡稱SPP）是蔗糖合成中的關鍵酶[3]，且2種酶都已定位于光合作用和儲存細胞的胞質溶膠中[4-6]。蔗糖合成途徑是以二磷酸尿苷葡糖（UDP-Glc）和6-磷酸果糖（F6P）為底物，蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化生成6-磷酸蔗糖（S6P），6-磷酸蔗糖（S6P）在磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）催化下水解形成蔗糖和磷酸根離子[7-8]。其中SPS的催化反應是可逆的，在最后一步中SPP的催化反應是不可逆的，而SPS和SPP又是以復合物的形式存在的，所以認為SPS和SPP共同催化蔗糖合成反應是不可逆的[9-10]。

磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）既是催化蔗糖合成途徑的最后一步，也是光合碳同化途徑中的最后一個酶[11-12]，與SPS相比有關SPP的研究報道相對比較少。相關研究表明，在植物體內SPS和SPP是以復合體的形式存在的，SPP催化生成 6-磷酸蔗糖（S6P）的同時二磷酸尿苷葡糖（UDP-Glc）存在時也能催化脫磷反應，且SPP的活性遠大于SPS，SPP可能在蔗糖合成過程中起重要的作用[13-15]。到目前為止，人們對芒果SPP基因的研究尚未見報道。由于SPP基因在蔗糖合成通路中有著舉足輕重的作用，影響可溶性糖的含量，本研究從芒果的果肉中克隆得到了1個MinSPP基因，并對該基因進行生物信息學分析以及對該基因的功能進行研究，為芒果果肉蔗糖合成的作用機制及該基因對果肉甜度的影響提供理論依據，為揭示該基因在芒果果肉蔗糖合成的分子機制提供了基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

本研究所用試材均取自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所的農業部儋州芒果種質圃，以貴妃芒為試材。使用的試劑有TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase、rTaq酶、克隆載體pEASY-Blunt、大腸桿菌Trans-T1感受態、農桿菌GV3101等。

1.2?試驗方法

1.2.1?芒果果肉總RNA的提取及cDNA的反轉錄

芒果果肉總RNA的提取參照天根生化科技（北京）有限公司生產的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進行相關的操作，用于普通PCR的cDNA合成方法詳見北京全式金生物技術有限公司TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書。

1.2.2?MinSPP基因的克隆

根據前期已經拼接得到的MinSPP基因的全長序列，設計上下游特異性引物擴增MinSPP基因（表1）。PCR反應體系：1 μL cDNA模板、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、10 μL TaKaRa PrimerSTAR Max DNA聚合酶和8 μL ddH2O。PCR反應程序：98 ℃預變性 5 s;98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸8 s，35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。連接pEASY-Blunt載體，轉化到Trans-T1大腸桿菌感受態細胞中，挑取陽性菌液送廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。

1.2.3?MinSPP基因的生物信息學分析

利用美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）上的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找MinSPP基因的開放閱讀框，并推測其氨基酸序列;運用ExPASy ProtParam軟件（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析MinSPP蛋白理化性質;使用ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）軟件分析氨基酸的疏水性與親水性;使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/Interactive）在線軟件預測并構建MinSPP蛋白的三級結構模型;利用NCBI上的BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索MinSPP蛋白的同源序列;使用NCBI中的Conserved domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析MinSPP蛋白序列的保守結構域;利用MEGA 7.0軟件進行同源序列比對并構建系統進化樹。

1.2.4?qRT-PCR分析MinSPP基因相對表達量

利用 Bio-Rad公司CFX96實時定量PCR儀進行試驗及數據分析。熒光定量所用酶為TransStart Tip Green qPCR SuperMix，反應體系：1 μL模板，上下游引物（10 pmol/μL）各0.3 μL，5 μL SuperMix，3.4 μL ddH2O，樣品設3次重復。反應程序：95 ℃預變性7 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環;60 ℃ 30 s，20 ℃停止。溶解曲線在60～95 ℃下進行數據采集。MinActin內參基因和MinSPP基因熒光定量引物見表2。

1.2.5?MinSPP基因表達載體的構建

將構建好的pEasyBlunt-MinSPP克隆載體和表達載體pBI121分別提取質粒，使用限制性內切酶KpnⅠ和XbaⅠ進行雙酶切。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別將目的基因和酶切后的載體條帶進行切膠回收。利用無縫克隆的方法將目的片段與載體進行同源重組，反應體系為：2 μL In-fusion同源重組酶，2 μL載體，5 μL目的片段，ddH2O補齊至10 μL。然后50 ℃反應 20 min，并迅速轉至冰上。轉化到Trans-T1大腸桿菌感受態細胞中，挑取陽性菌液擴繁提質粒后進行雙酶切檢測，最后轉化GV3101農桿菌感受態，篩選陽性菌液，將菌液與50%甘油按照體積1 ∶1混合，于-80 ℃保存。

2?結果與分析

2.1?貴妃芒果果肉總RNA的提取

本研究提取貴妃芒果果肉總RNA，用核酸蛋白儀測定其濃度為800～1 000 ng/μL，純度D260 nm/D280 nm的比值為1.8～2.0，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有2條清晰完整的條帶（圖1）。

2.2?MinSPP基因全長的克隆

以貴妃芒果青熟期果肉cDNA為模板，以ORF兩側設計引物克隆得到MinSPP基因全長。利用ORF Finder分析得到基因CDS區為1 275 bp，編碼424個氨基酸，蛋白質分子質量為48.46 ku，等電點為5.34。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到目的片段約1 300 bp（圖2），與預期結果一致。

2.3?MinSPP基因序列、同源性、結構域及進化樹分析

根據SPP基因編碼蛋白序列，在NCBI上利用BLASTP搜[CM（25]索并下載該蛋白的同源序列。選擇與MinSPP同源性較高的物種，分別為毛果楊（Populus trichocarpa）、克萊門柚（Citrus clementina）、麻瘋樹（Jatropha curcas）和巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis），與芒果MinSPP蛋白序列同源性分別為77%、77%、75%、73%，說明它們之間的親緣關系很近（圖3）。使用NCBI上的Conserved domains分析MinSPP蛋白結構域，結果顯示MinSPP基因含有PLN02382、SPP plant-cyano、S6PP、HAD_SPP、Cof共5個結構域（圖4）。采用ProtParam Tool軟件對MinSPP蛋白的親水/疏水性進行了分析（圖5），其中MinSPP蛋白的親水性平均系數的數值為-0.350，說明該蛋白為親水性蛋白。不穩定指數（Ⅱ）計算為44.68，說明該蛋白質分類為不穩定。采用在線軟件預測MinSPP蛋白的三級結構并構建該蛋白的三級結構模型（圖6）。利用MEGA 7.0中ClustX多序列比對，鄰位相連法構建系統發育樹（圖7），結果顯示，芒果SPP（Mangifera indica L.）與克萊門柚SPP（Citrus clementina）在同一分支上，說明它們之間的蛋白親緣關系較近。

2.4?芒果果肉在后熟處理中MinSPP表達量

利用qRT-PCR分析MinSPP在青熟期到完熟期（用乙烯催熟每間隔24 h取樣）果肉的表達量變化，結果如圖8所示。從柱狀圖中可以看出，MinSPP基因在芒果后熟處理5 d的相對表達量最高，在之后的完熟過程中MinSPP基因的相對表達量逐漸降低。

2.5?MinSPP基因表達載體的構建

使用TaKaRa PrimerSTAR Max DNA聚合酶擴增基因全長，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測且用膠回收試劑盒回收目的條帶，將pBI121空載體用KpnⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，1.0%瓊[CM（25]脂糖凝膠電泳檢測且用膠回收試劑盒回收目的條帶，然后用無縫克隆的方法連接2個回收后的條帶，構建表達載體pBI121-MinSPP，轉化到Trans-T1大腸桿菌感受態細胞中，挑取陽性菌液進行擴繁，之后提取pBI121-MinSPP重組質粒，再用KpnⅠ和XbaⅠ進行雙酶切驗證，酶切目的基因片段為1 300 bp（圖9-A），與預期結果吻合，表明pBI121-MinSPP重組質粒表達載體構建成功。pBI121-MinSPP轉化到GV3101農桿菌，菌液PCR檢測到目的基因已成功轉化到農桿菌菌株（圖9-B）。

3?討論與結論

在植物蔗糖合成過程中SPP無處不在，不管是藻類植物、裸子植物、被子植物還是在細菌中，都發現SPP存在[13，16-17]，也有研究表明，水稻、小麥和玉米的葉片中SPP活性和SPS活性相當，它們都是以復合體的形式存在于植物中，因此SPP可能在蔗糖合成過程中發揮著重要的作用[14，18-19]。從芒果青熟期到完熟期各生育時期的變化可以明顯地看到SPP基因表達量的變化，說明在芒果果肉蔗糖合成過程中SPP也發揮著關鍵作用。而在芒果中SPS和SPP之間的關系需要進一步研究與討論。

到目前為止，人們對于芒果中SPP基因研究甚少，本研究從芒果蔗糖合成途徑中的關鍵基因MinSPP進行相關研究分析，發現在不同物種的同源序列比對中蛋白比對的一致性為85.61%，說明它們之間的親緣關系較近。從系統進化樹中可以看出，芒果MinSPP基因與克萊門柚CclSPP基因在同一分支上，說明它們之間的蛋白親緣關系較近。熒光定量分析芒果后熟過程中MinSPP相對表達量水平變化，結果顯示MinSPP在從青熟期到成熟期芒果果肉中的表達量逐漸上升的，從成熟期到完熟期芒果果肉中的表達量逐漸降低，其中成熟期芒果果肉中表達量較高。說明芒果在成熟期合成蔗糖含量較高，推測芒果從青熟期到完熟期對合成蔗糖含量的變化是從上升到下降的趨勢，從而可以印證在果實成熟過程中蔗糖的積累與SPP基因是有直接聯系的。本研究進一步構建了pBI121-MinSPP重組過表達載體，對芒果蔗糖含量的功能變化還需要進一步在轉基因植物中表達進行驗證，為研究MinSPP基因在芒果后熟過程中的作用機制提供理論支撐。

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