翦股穎不同外植體高頻植株再生的研究

鮑榮靜 梁棟 梁慧敏

摘要：以翦股穎品種高地的吸漲種子、胚芽生長點和胚根生長點為主進行不同外植體高頻植株再生的研究，結果表明，不論是愈傷組織的誘導還是胚性愈傷組織的形成以及叢生芽的分化，均以胚芽生長點為最高，其次是吸漲種子，胚根生長點最低;高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導;但適時調整激素配比及繼代時間對形成胚性愈傷組織及叢生芽的分化更關鍵有效。試驗分析得出高頻胚性愈傷組織形成的激素配比為2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，高頻叢生芽分化的激素配比為2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

關鍵詞：翦股穎;外植體;愈傷組織誘導;胚性愈傷組織形成;叢生芽分化

中圖分類號： S688.404.+3?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0091-04

翦股穎（Agrostis stolonifera）是一種多年生冷季型草坪草，耐低修剪、匍匐生長力強、葉片細密成坪速度快，易形成觀賞性高的草坪，在世界各地被廣泛種植，也是我國北方地區高檔草坪及高爾夫果嶺等運動場建植的常用草種[1]。我國目前所用的多種翦股穎草種均由國外引進，由于生長環境差異大，這些草種在我國很多地區表現不盡如人意，尤其是在華東及其以南高溫高濕的地區常常表現耐熱性、抗病蟲害能力弱、耐磨性低等，使得草坪質量在使用過程中很快變差，養護管理成本加大，易出現斑禿、綠期縮短等問題。因此，利用現代細胞生物工程技術進行翦股穎品種改良將是一條快捷有效的途徑。而建立翦股穎合適的外植體高頻組培再生體系是進行品種遺傳改良的重要前提。

本研究以翦股穎品種高地為主，選其3種外植體，以在MS基本培養基中添加不同濃度激素的配方設計為處理，并進行相應培養條件的調控，誘導3種外植體形成愈傷組織和胚性愈傷組織，進而分化出叢生芽及完成種苗壯苗生根培養等過程，摸索出翦股穎高頻組培再生植株合適的外植體、適宜的激素配比或配方、不同生長發育階段合適的培養條件等，為翦股穎進一步的品種改良打下基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

供試的翦股穎品種為高地（Highland），種子由北京克勞沃草業中心提供。

1.2?方法

1.2.1?試驗時間和地點?試驗從2016年3月至2018年3月在江蘇農林職業技術學院農學園藝學院組培實驗室進行。

1.2.2?材料消毒與處理?將上述翦股穎成熟種子先用洗滌劑浸泡10 min，再用流水沖洗5～10 min，之后用2% NaClO溶液攪拌消毒10 min，放入75%乙醇浸泡40 s，取出用0.1% HgCl2攪拌消毒5～8 min，用滅菌水沖洗6～8遍，然后再放入滅菌溫水（35～40 ℃）浸泡，直至種子吸漲種皮變軟后，用無菌濾紙吸干水分，即可用于接種。

1.2.3不同外植體的獲得與初始培養?通過下述方法可獲得3種外植體用于初始培養。吸漲種子（A）：取一部分種皮變軟的吸漲種子直接接種到誘導培養基上;帶生長點胚芽（B）：將吸漲種子先接種到只含瓊脂的空白培養基上，待種子長出胚芽后，切取0.5～1.5 cm大小的具有生長點的胚芽作為外植體接種到誘導培養基上;帶生長點胚根（C）：將吸漲種子先接種到只含瓊脂的空白培養基上，待種子長出胚根后，切取0.5～1.0 cm大小的帶有生長點的胚根作為外植體接種到誘導培養基上。

1.2.4?愈傷組織的誘導及繼代胚性愈傷組織形成的培養?接種外植體的誘導培養基及繼代培養基以MS培養基為基本培養基，其中又添加了不同生長素與細胞分裂素等激素調配成不同濃度組成的配方;每個培養瓶接種10個外植體，每個配方接種30瓶，放置在（25±3） ℃培養架上暗培養25～30 d后，統計愈傷組織誘導率;中間繼代1次，即50～60 d后，統計胚性愈傷組織的形成率。

1.2.5?叢生芽的分化培養?將繼代培養50～60 d的愈傷組織，轉接到設計好的添加不同濃度激素的以 MS培養基為基本培養基的分化培養基上，每個處理每瓶接種6個愈傷組織，每個配方接種20瓶，進行分化培養。培養條件：白天22～25 ℃，夜晚18～20 ℃，光照時間16 h/d，光照度1 500～2 000 lx;50～60 d后，統計叢生芽分化率。

1.2.6?壯苗生根培養?將分化的叢生芽轉接到設計好的添加不同濃度生長素的以MS培養基或1/2 MS培養基為基本培養基的生根培養基上，每個處理每瓶接種6個叢生芽，每個配方接種20瓶，同樣放置在白天22～25 ℃，夜晚18～20 ℃，光照時間16 h/d，光照度2 000～2 500 lx，進行壯苗生根培養，20～25 d后，觀察再生植株的生長情況并統計根的誘導率。

1.3?數據處理與指標計算公式

采用Excel 2007進行計算與制表，各項指標的計算公式如下：

愈傷組織誘導率=形成愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100%;

胚性愈傷組織形成率=胚性愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100%;

叢生芽分化率=形成叢生芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100%;

生根率=生根的叢生芽數/接種的叢生芽數×100%。

2?結果與分析

2.1?不同激素配比對不同外植體愈傷組織誘導及胚性愈傷組織形成的影響

2.1.1?不同激素濃度配方對不同外植體愈傷組織誘導的影響?在愈傷組織誘導培養基上，通過加入不同濃度的2，4-D、6-BA和NAA，設置6個配方處理，處理時間為30 d，研究其對翦股穎的不同外植體的愈傷組織誘導的影響。從表1可以看出，3種外植體經過6個配方處理30 d后，均能誘導出愈傷組織，證明誘導愈傷組織的成敗關鍵主要不是試驗材料，而是培養條件，尤其是激素成分配比很重要[2];但出愈率高低快慢是和取材的外植體部位有關系的。本試驗結果表明，3種外植體在同一配方條件下出愈率差異顯著（P<0.05），其中以胚芽生長點為最高，6個配方處理均高于吸漲種子和胚根生長點;其次是吸漲種子，胚根生長點最低，說明胚芽生長點細胞在離體狀態下對培養條件特別是激素很敏感，可快速進入脫分化狀態，成為迅速增殖的愈傷組織。試驗所設置的6個配方之間出愈率差異也較大，總體趨勢：隨著2，4-D質量濃度的升高，出愈率增加，當2，4-D質量濃度為3.0 mg/L（配方4）時，3種外植體出愈率均高于其他配方，達到最大;隨著2，4-D質量濃度的降低，3種外植體出愈率均下降，綜合順序表現為配方4>配方6>配方3>配方5>配方2>配方1;其中配方1中無2，4-D，但添加較高濃度的NAA，說明生長素對愈傷組織的誘導起關鍵作用，但2，4-D對提高出愈率更有利[3]。

2.1.2?不同激素濃度配方處理對不同外植體胚性愈傷組織形成的影響?3種外植體在6個配方處理下生長58～60 d（中間繼代1次）后，統計胚性愈傷組織形成率。由表2可見，胚芽生長點經過6個配方60 d左右處理后，除配方1外其他5個配方胚性愈傷組織形成率明顯高于吸漲種子和胚根生長點;吸漲種子稍差，胚根生長點最差;說明胚芽生長點不論是作為愈傷組織誘導還是胚性愈傷組織形成都是最好的外植體。從6個配方處理來看：配方1處理胚性愈傷組織形成率很低甚至沒有，說明2，4-D是翦股穎外植體形成胚性愈傷組織的關鍵因子;配方處理6胚性愈傷組織形成率最高，其他配方依次下降，順序為配方5>配方4>配方2>配方3。

結合表1與表2結果發現，6個配方處理愈傷組織誘導率和胚性愈傷組織形成率并不一致，愈傷組織誘導率受 2，4-D 濃度的影響較大，而胚性愈傷組織形成率主要是培養基中不同種類激素之間的相互作用的綜合表現[2]。

2.1.3?繼代培養時間對胚性愈傷組織形成的影響?脫分化的細胞在形態發生上具有較大的可塑性[2]，3種外植體培養28～30 d繼代1次，接種到新鮮的原培養基培養50～60 d時，所有成熟細胞逐漸脫分化轉變為由各種類型的細胞組成的愈傷組織，隨著繼代次數的增加及培養時間的延長，3種外植體不管是放在哪個配方下愈傷組織的分化能力都是逐漸下降甚至消失的（圖1、圖2、圖3和圖4）;同時觀察到，經過長時間繼代的愈傷組織易產生毛狀物，褐變率也有明顯的上升。

導致愈傷組織分化能力下降的原因主要是愈傷組織的類型有差異，主要分為3類：第1類生長迅速，初期愈傷組織乳白色，但后期易發褐并產生纖細根毛，這種愈傷較難分化出芽;第2類愈傷組織生長較快，呈淡乳黃色，黏性較大，觸碰能明顯感覺到緊實的瘤狀結構，這種愈傷大部分為胚性愈傷，易萌出叢生芽;第3類愈傷組織呈水漬狀易褐化，這種愈傷也較難分化。3種外植體均可形成這3類愈傷組織但差異明顯，其中胚芽生長點易形成第2類胚性愈傷組織; 吸漲種子以第2類居多，第1類較少;胚根生長點主要是第1類。在6個配方之間這3類愈傷組織也存在明顯差異，其中配方1以第3類愈傷為主;配方2、配方3、配方4以第1類愈傷居多，第2類愈傷較少;配方5和配方6主要產生第2類愈傷。

2.2?不同激素濃度配方對不同外植體叢生芽分化率的影響

由表3可見，胚芽生長點的6個配方叢生芽分化率均明顯高于吸漲種子，吸漲種子又均明顯高于胚根生長點，說明最好的外植體是胚芽生長點。6個配方叢生芽分化率也有差異，排序為配方5>配方4>配方6>配方3>配方2>配方1，可以看出最好的配方配比是配方5，最差的是配方1。

2.3?基本培養基營養減半及IBA濃度不同對生根的影響

從表4可以看出，基本培養基營養成分是否減半對翦股穎叢生芽的生根率沒有明顯影響，所以在實際應用時，若需大量生產組培苗，為節約成本可以使用低濃度的無機鹽培養基即1/2MS。試驗結果也表明培養基中添加不同濃度IBA對生根率影響不明顯，但若無IBA，則對生根率有明顯的影響。

3?討論

翦股穎組培外植體一般采用的是成熟種子，目前還未見有以翦股穎吸漲種子、胚芽生長點及胚根生長點作為外植體，系統地研究植株高效再生技術的報道。通常多細胞植物都有誘導產生愈傷組織的潛在可能性[2]?但不同外植體的分化能力會有明顯的差異，其中胚性愈傷組織的誘導率可作為分化能力的指標[4]。本試驗結果也印證了上述說法，即3種不同外植體間盡管都能誘導出愈傷組織，但不論是愈傷組織的誘導率還是胚性愈傷組織的形成率以及叢生芽的分化率，均表現出了明顯的差異，而胚性愈傷組織的形成率和叢生芽的分化率表現出高度的一致性，這也說明胚性愈傷組織的誘導率作為分化率的指標是可行的。試驗結果也說明了胚芽生長點具有很強的脫分化及再分化形成再生植株的能力?是最佳的高頻外植體，為建立一個高效的翦股穎組培再生體系奠定了試驗基礎;其次吸漲種子也可以作為一個備選外植體，但胚根生長點太低可以淘汰掉。

較高濃度的生長素和較低濃度的細胞分裂素或無細胞分裂素的固體培養基對大部分草坪草愈傷組織的誘導是沒有問題的，但是否形成胚性愈傷組織乃至能否分化出叢生芽則與外植體的年齡、生理狀態、培養基的組成、激素的種類和濃度、培養條件等有關，其中培養條件是關鍵[5]，尤其是激素成分及配比很重要[2]，2，4-D是誘導胚性愈傷組織的重要激素[6]，較高濃度的2，4-D也有利于胚性愈傷組織的形成[7-9]，但合適的激素配比及繼代時間對胚性愈傷組織的形成以及叢生芽的分化更高效;依據本試驗的結果，分析得出高頻胚性愈傷組織形成的激素配比為2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;高頻叢生芽分化的激素配比為2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導，但愈傷大多為松散的高度液泡化的薄壁細胞組成，所以并不利于胚性愈傷組織的形成及叢生芽的分化，而誘導培養基中加入少量的6-BA和NAA反倒對胚性愈傷組織的形成起促進作用并有利于叢生芽的分化。本試驗的研究結果為建立一個高效的翦股穎組培再生體系提供了一條有效地途徑，圖5至圖8是翦股穎高頻組培再生植株的現場圖片。

參考文獻：

[1]王明蓉，羅富成. 優質草坪草-匍匐翦股穎[J]. 四川草原，2003（6）：60-61.

[2]崔凱榮，戴若蘭. 植物體細胞胚發生的分子生物學[M]. 北京：科學出版社，2000：4-29.

[3]Chai M，Jia Y，Chen S，et al. Callus induction，plant regeneration，and long-term maintenance of embryogenic cultures in Zoysia matrella （L.） Merr.[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2011，104（2）：187-192.

[4]梁慧敏，黃?劍，夏?陽，等. 苜蓿外植體再生系統的建立研究[J]. 中國草地，2003，25（4）：8-14.

[5]梁慧敏，夏?陽，王永平，等. 草坪草體胚發生及應用于現代育種[J]. 山東林業科技，2008，38（5）：83-86，108.

[6]崔凱榮，邢更生，周功克，等. 植物激素對體細胞胚胎發生的誘導與調節[J]. 遺傳，2000，22（5）：349-354.

[7]王曉春，師尚禮，梁慧敏，等. 2，4-D和6-BA組合配比對金達苜蓿愈傷組織誘導與分化的影響[J]. 草地學報，2010（2）：219-222.

[8]陳智勇，易自力，趙運林. 匍匐翦股穎愈傷組織誘導及其分化的研究[J]. 園藝學報，2003，30（5）：562-562.

[9]梁月香，梁慧敏，燕麗萍，等. 紅葉石楠莖段再生快繁體系的建立[J]. 江蘇農業科學，2011，39（6）：68-70.