溫陽健脾祛痰顆粒含藥血清對非酒精性脂肪性肝病細胞模型TLR4／TRIF／NF-κB通路的影響

李 暉 ，張澤鳳 ，2，楊 超 ，林俊芝 ，趙梓亦 ，陳昌金

（1.成都中醫藥大學附屬醫院中心實驗室，四川 成都 610072；2.成都中醫藥大學臨床醫學院，四川 成都 610072；3.廣東省中醫院，廣東 廣州 510120）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺傳-環境-代謝應激相關性肝病，包括單純性脂肪肝及脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）［1］。 目前，NAFLD 已成為慢性肝病的主要病因，西方發達國家NAFLD發病率約為20%～30%，其中20%進展為肝硬化［2］；亞洲發病率為5%～18%，我國發達地區發病率亦達到15%左右［3］。 NAFLD 發病機制復雜［4-6］，現代醫學目前對NAFLD尚無特效的治療藥物，主要采取生活方式干預、胰島素增敏劑、抗氧化劑等治療措施［7］，干預作用有限，針對不同靶點及多層次靶向聯合治療是進行NAFLD干預的方向。中醫藥具有多途徑、多層次、多靶點綜合藥理作用的特點，在治療NAFLD方面具有優勢［8］。 溫陽健脾祛痰顆粒（WYJPQT）是筆者經驗方，作為協定處方在臨床上應用多年，對于NAFLD的治療取得了良好療效，且價格低廉，但需要進一步明確其作用機制。

本研究在應用HepG2細胞建立NAFLD細胞模型的基礎上，研究WYJPQT含藥血清對該細胞模型的治療作用。由于慢性炎癥在NAFLD發生、發展過程中發揮重要作用，TLR4／TRIF／NF-κB 信號通路是體內重要炎癥通路，與NAFLD的進展具有明確的聯系，以此為切入點，進一步探討WYJPQT與TLR4／TRIF／NF-κB信號通路的相關性，明確其作用靶點，為推廣WYJPQT的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞株 Wistar雄性大鼠70只，體質量（220±20）g，購自成都達碩實驗有限公司，SPF級，動物生產許可證編號：SCXK（川）2015-030；在溫度（25±2）℃，12 h光照／d條件下，普通飼料，清水飼養于成都中醫藥大學附屬醫院實驗動物房適應性喂養1周，大鼠無死亡，一般情況良好。肝癌細胞株HepG2由中心實驗室保存。

1.1.2 實驗藥物 溫陽健脾祛痰顆粒（WYJPQT）系筆者經驗方，作為協定處方使用多年，由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科制備為顆粒劑，主要由淫羊藿、炙黃芪、茯苓、炒白術、澤瀉、陳皮、法半夏、焦山楂、丹參等組成。制備方法：全方藥物加入8倍量水，浸泡 40 min，煎煮 3次，每次 50 min，合并 3次濾液，濃縮至相對密度1.3；加入糊精，混合，在75℃下鼓風干燥6 h，粉碎過篩；加入80%乙醇，制粒，65℃下鼓風干燥4 h，整粒，分包裝至10 g。陽性對照藥物多烯磷脂酰膽堿膠囊（賽諾菲北京制藥有限公司），購于成都中醫藥大學附屬醫院。

1.1.3 實驗試劑及主要儀器 DMEM培養基、胰蛋白酶（美國 Gibco 公司）；油酸（Oleic acid，OA，美國MP公司）；油紅O、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（美國Thermo公司）；三酰甘油（TG）檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；異丙醇（成都科龍化工試劑廠）；4%多聚甲醛（天津市進豐化工有限公司）；Toll樣受體 4（TLR4）上下游引物為 F：5'TTCACTTCCTCTCACCCTTT 3'，R：5'GCATCATCCTCACTGCTTC 3'；核因子 κB（NF-κB）上下游引物為F：5'TCATCCACCTTCATTCTCAAC 3'，R：5'ATCCTCCACCACATCTTCC 3'；髓樣分化因子88（MYD88）上下游引物為 F：GCTGACTTGGAGCCTG ATTC；R：GATAGGCATGTCAGGGGAGA；Toll樣白介素-1受體結構域適配子誘導干擾素-b（TRIF）上下游引物為 F：CAGGAGCCTGAGGAGATGAG，R：CTG GGTAGTTGGTGCTGGTT；內參β-actin上下游引物為 F：5'TCTCCCAAGTCCACAAGG 3'，R：5'GGGCA CGAAGGCTCATCA 3'；TLR4多克隆抗體（英國Abcam公司，ab13556）；TRIF單克隆抗體（英國Abcam公司，ab180689）；MYD88單克隆抗體（英國 Abcam公司，ab133739）；NF-κB 單克隆抗體（美國 CST 公司，#6956）；CO2培養箱（美國 Nuare 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；實時熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司，型號：ABI 7500）；超純水儀（法國Milipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將Wistar雄性大白鼠70只隨機分成WYJPQT高、中、低劑量組，陽性對照組及空白對照組，每組各14只。以上5組大鼠中，除空白對照組外，均予以藥物干預，其中，WYJPQT高、中、低劑量組服用 WYJPQT 生藥 8.8、4.4、2.2 g／（kg·d），將顆粒稀釋后等體積灌胃；陽性對照組予多烯磷脂酰膽堿膠囊 0.122 g／（kg·d）；每日藥量分 2 次灌胃，間隔8 h；空白對照組予生理鹽水，連續7 d。標本采集前，所有大鼠禁食12 h；于末次給藥1 h后，采取下腔靜脈取血的方式，收集全血，4℃靜置過夜后離心，4 000 rpm×15 min，取血清，56℃ 30 min滅活，以除去可能存在的生物活性物質對實驗結果的影響，0.22 μm過濾器過濾除菌，-80℃保存備用。

1.2.2 NAFLD細胞模型的制備及鑒定 HepG2細胞用含10%FBS的DMEM完全培養基，置于5%CO2孵箱中，37℃培養，觀察細胞形態變化，待細胞匯合度為70%～80%時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3傳代，將處于對數生長期的HepG2細胞以1×105個／孔接種于12孔培養板中，細胞貼壁后，棄掉原有培養液，加適量PBS緩沖液洗兩遍；模型組加入含0.25 mM OA的培養基繼續培養24 h。

取對數生長期的HepG2細胞以1×105個／孔接種于12孔培養板中，吸棄培養孔的培養基，預熱的PBS洗3次，每次約5 min；用預熱的4%多聚甲醛固定30 min，棄多聚甲醛液，PBS洗2次，每次2 min；每孔加入60%異丙醇同步化液 1 mL 1～2 min，加入油紅O工作液每孔1 mL室溫下避光放置30 min；吸棄油紅O工作液，每孔加入1 mL 60%異丙醇進行分色約30 s；每孔加入1 mL雙蒸水（ddH2O）洗3 min，每孔加入1 mL蘇木素染色3～5 min，每孔加入 1 mL ddH2O洗 3次，每次 2 min；每孔加入1 mL ddH2O液封，倒置顯微鏡下觀察，取不同倍數不同視野拍照。BCA蛋白檢測試劑盒檢測細胞內蛋白含量，按說明書操作；三酰甘油檢測試劑盒檢測細胞內三酰甘油（TG）含量，計算細胞內TG／蛋白比值。

1.2.3 含藥血清處理NAFLD的細胞模型 將對數生長期的HepG2細胞以5×104個／孔的密度接種于24孔細胞培養板中，培養24 h后，待細胞匯合度為70%～80%時，吸棄培養基，NAFLD模型組給予含0.25 mM OA培養基造模24 h后，吸棄培養基，用PBS清洗每孔細胞兩遍后，將NAFLD細胞模型隨機分為5組（WYJPQT高、中、低劑量組，陽性對照組，模型組），同時設置空白對照組，每組4個復孔。WYJPQT高、中、低劑量組分別加入相對應的不同濃度10%WYJPQT含藥血清培養基處理48 h，陽性對照組給予10%多烯磷脂酰膽堿含藥血清培養基處理48 h，模型組和空白對照組則給予含10%大鼠血清培養基處理48 h后，分別進行油紅O染色和細胞內TG含量、蛋白含量測定，確定TG／蛋白比值。

1.2.4 逆轉錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測細胞中的 TLR4、TRIF、MYD88 和 NF-κB mRNA表達情況 收集細胞，抽提細胞總RNA，mRNA逆轉錄為cDNA，進行定量PCR檢測。設定20 μL體系，包括 cDNA 4 μL、Forward primer （F1） 0.5 μL、Reverse primer （F2） 0.5 μL、SYBR?Green PCR Master Mix 10 μL、Nuclease-Free Water 5 μL，反應條件為預變性95℃ 10 min；變性95℃ 15 s；退火、延伸60℃ 1 min，共40個循環。以β-actin為參照基因，觀察CT值的變化，測基因表達相對含量。各組基因相對表達含量計算公式：ΔCT＝目標基因-內參基因，ΔΔCT＝ΔCT（實驗組）-ΔCT（空白對照組），計算 2-ΔΔCT（實驗組包括 WYJPQT 高、中、低劑量組，陽性對照組，模型組）。

1.2.5 蛋白印跡法（Western blot）檢測細胞中TLR4、MYD88、TRIF、NF-κB蛋白的表達情況 RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉移至PVGF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗、二抗孵育，經ECL發光，X線膠片曝光、顯影及定影，并以計算機圖像掃描進行圖像分析，測定灰度值以代表蛋白的表達量。

1.3 統計學方法 用SPSS 21.0統計軟件分析。若各組滿足正態分布、方差齊，同一指標間可采用單因素方差分析；組間兩兩比較，可采用LSD－t檢驗或非參數檢驗。

2 結 果

2.1 WYJPQT含藥血清處理NAFLD細胞模型后的油紅O染色結果 0.25 mM OA誘導HepG2細胞24 h，油紅O染色發現，空白對照組細胞邊緣清晰，胞漿豐富，核膜完整，細胞核被染成藍色，細胞內未見明顯紅色脂滴；而模型組細胞內出現很多大小不等的紅色脂滴，脂肪變嚴重，部分甚至融合成片，確定NAFLD細胞模型成功建立。含藥血清處理48 h后，油紅O染色示，空白對照組細胞胞膜光滑，細胞核染成藍色，細胞內未見明顯紅色脂滴顆粒；模型組，WYJPQT高、中、低劑量組，陽性對照組中細胞核被染成藍色，細胞內均出現紅色脂滴顆粒。與模型組相比，WYJPQT高、中、低劑量組及陽性對照組細胞內紅色脂滴顆粒略微減少；WYJPQT高、中、低劑量組與陽性對照組相比，細胞內紅色脂滴顆粒數差異不明顯，見圖1。

2.2 6組TG／蛋白比值比較 0.25 mM OA誘導HepG2細胞24 h，檢測細胞內TG／蛋白比值變化，與空白對照組比較，模型組細胞內TG／蛋白比值明顯增高，確定NAFLD細胞模型成功建立。WYJPQT高、中、低劑量含藥血清處理48 h后，各組TG／蛋白比值見表1。

2.3 6 組 TLR4、TRIF、MYD88 和 NF-κB mRNA 相對表達水平結果 見圖2。

2.4 6組 TLR4、TRIF、MYD88和 NF-κB 的蛋白相對表達水平結果 見圖3。

圖1 6組NAFLD細胞模型的油紅O染色圖（×400）

表1 各組TG／蛋白比值比較（）

表1 各組TG／蛋白比值比較（）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與陽性對照組比較，3） P＜0.05。

TG／蛋白比值 ／（mmoL／gprot）1.17±0.24 3.18±0.291）2.46±0.292）3）2.51±0.222）3）2.19±0.252）1.97±0.222）組別空白對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組陽性對照組

圖2 6組TLR4、TRIF、MYD88和NF-κB mRNA相對表達水平結果圖

3 討 論

NAFLD隸屬于中醫學的“脅痛”“痰證”“瘀血”“積聚”“肥氣”“肝癖”等范疇。清代葉天士指出：“夫肌膚柔白屬氣虛，外似豐溢，里真大怯，蓋陽虛之體，惟多痰多濕……”，闡明肥胖人多為本虛標實——氣虛陽虛為本、多痰多濕為標。該病主要由飲食不節或體虛濕滯，導致肝失疏泄，脾失健運，腎虛氣化不及，以致痰濕內生，脂膏沉積于肝。脾虛是本病的發病基礎，痰濕為致病因素，本虛標實為病機特點［9］。

圖3 6組TLR4、TRIF、MYD88和NF-κB的蛋白相對表達水平結果圖

WYJPQT是以“脾腎虧虛，痰濕內蘊”為病機學說，以“溫陽健脾，祛痰化濕”為基本治則，六君子湯合澤瀉湯加減化裁而形成。由六君子湯是在四君子湯的基礎上加入半夏和陳皮，補氣健脾，燥濕化痰；而澤瀉湯出自醫圣張仲景《金匱要略》，為治療痰飲水濕證經典方劑。兩方合用，痰濕得除，脾得健運，標本兼治。WYJPQT全方配伍得當，首重健脾益氣祛痰濕，做到“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”。脾氣旺，則痰濕生化無源。配伍淫羊藿，健脾補腎同時助陽化氣，陽氣盛則濁陰消，體現了標本兼治的原則。

本研究選用OA誘導HepG2細胞建立NAFLD細胞模型。NAFLD的細胞模型目前主要是通過利用不同比例濃度的油酸、棕櫚酸、脂肪乳等來誘導HepG2、L02、Huh7 等細胞建立模型［10-11］。 大量的實驗證明：HepG2細胞雖然是腫瘤細胞，但和正常肝細胞在生物學特點和功能上存在相似性，具備肝臟各種細胞特性，油酸、棕櫚酸等誘導劑都可以促使肝細胞和HepG2細胞發生脂肪變性。相比而言，HepG2細胞對脂毒性的耐受力更強，因此是脂肪變性細胞模型中最具優勢和前景的備選細胞［12］。目前利用OA誘導HepG2細胞建立NAFLD細胞模型已屬于比較成熟的方法。本研究采取0.25 mM OA誘導HepG2細胞24 h，采用油紅O染色后，發現OA誘導組細胞內可見大小不等的紅色脂滴顆粒，部分融合成片，細胞脂質蓄積明顯；檢測細胞內TG含量，OA誘導組細胞內TG／蛋白比值明顯高于空白對照組，說明0.25 mM的OA刺激HepG2細胞24 h構建NAFLD細胞模型成功。

本研究結果顯示：WYJPQT高、中、低劑量含藥血清和陽性對照組均能降低NAFLD細胞中TG／蛋白比值，從而改善NAFLD細胞內脂質蓄積的狀況；WYJPQT低劑量組降低TG的作用與陽性對照組相當。

本研究應用OA刺激HepG2細胞，大量脂肪酸進入細胞內，游離的脂肪酸刺激TLR4產生，通過TRIF或MYD88信號通路向下傳遞激活NF-κB，使炎癥因子IL-6、TNF-α等炎癥因子大量釋放，導致TG的沉積，從而引起肝細胞脂肪變性、壞死［13-16］。以此為出發點，我們分別應用RT-qPCR法和Western blot法檢測細胞內 TLR4、TRIF、MYD88 及 NF-κB mRNA和蛋白的表達情況，結果顯示，與模型組相比，WYJPQT高、中劑量組能夠顯著下調TLR4 mRNA表達，優于陽性對照組；高、中、低劑量組均能降低NF-κB mRNA表達量，中、低劑量組與陽性對照組作用相當。表明WYJPQT含藥血清能夠降低NAFLD細胞模型中TG／蛋白比值，其機制之一可能與下調TLR4基因表達量，抑制NF-κB的活性有關。而Western blot法檢測結果與RT-qPCR法結果不完全一致：模型組TRIF、MYD88蛋白表達量較空白對照組明顯上調；與模型組比較，WYJPQT高、中劑量組TRIF蛋白表達量明顯下調，高劑量組TRIF蛋白表達量與陽性對照組相當；WYJPQT各劑量組NF-κB相對蛋白表達量出現顯著下調，而MYD88相對蛋白表達量則明顯升高。

因此，可以初步得出以下結論：WYJPQT對NAFLD細胞模型具有治療作用，降低細胞內TG／蛋白比值，降低TRIF、NF-κB表達量；而對于TLR4的影響主要集中在mRNA水平，對蛋白表達水平影響不明顯，其原因可能跟TLR4／NF-κB信號通路在不同的細胞發揮不同的作用有關［14］；WYJPQT各劑量組MYD88的表達水平呈現升高態勢，因此WYJPQT主要通過調控TLR4／TRIF／NF-κB信號通路達到對NAFLD細胞模型的治療作用，對MYD88的表達影響則需要深入進行驗證。

NAFLD發病機制非常復雜，本研究僅對其中TLR4／TRIF／NF-κB信號通路進行了初步探討。后續研究考慮在動物實驗模型上驗證WYJPQT的療效，深入探討其作用機制，為臨床上應用WYJPQT治療NAFLD提供可靠依據。