自噬在胰腺癌及其治療中作用的研究進展

張 超， 王偉藝 綜述 唐文皓 審校

（復旦大學附屬華東醫院普外科，上海 200040）

中國國家癌癥中心2018年統計數據顯示，胰腺癌發病率雖然列中國城市男性惡性腫瘤第8位，但死亡率居第5位［1-2］，5 年生存率為 2%～9%［3］。 胰腺癌之所以成為致命的惡性腫瘤之一，是因為其發現困難且易轉移。臨床上晚期病人多見，治療手段有限，且胰腺癌對大多數化療方案有高耐藥性［4］。因此，研究胰腺癌發生、發展的生物學特性和機制，并尋找新的治療方法成為當前的熱點，而自噬是貫穿胰腺癌發生、發展的重要機制，也是胰腺癌耐藥的原因之一［5］。本文就自噬與胰腺癌之間的關系及自噬在胰腺癌放、化療中作用的研究進展作一綜述，并討論自噬作為胰腺癌治療新靶點所面臨的問題及可能的解決方案。

自噬的定義及功能

巨自噬(簡稱自噬)是細胞降解損傷的蛋白質及細胞器的生理過程。自噬可在細胞受到饑餓、高溫、低氧及激素等刺激，或細胞器損壞、突變蛋白質積聚及微生物侵襲等應激時發生，以此維持細胞內穩態并提高細胞生存能力，同時也是一種細胞死亡機制。

自噬有以下幾個功能［6-7］。①降解作用：去除損傷的生物大分子及細胞器，維持細胞穩態，幫助細胞重構。降解的同時為細胞提供能量，提高細胞在惡劣環境的生存能力。降解的產物為合成葡萄糖、氨基酸及新的細胞器等提供物質基礎。②運輸作用：自噬可作為從細胞質到溶酶體或液泡的通路。自噬也用于主要組織相容性復合物(MHC)Ⅱ類分子提呈內源性抗原。③誘導細胞死亡：過度激活細胞自噬可導致細胞程序性死亡，即Ⅱ型程序性死亡，是除凋亡外的另一種程序性細胞死亡通路。

自噬與胰腺癌

一、自噬與胰腺癌的發生、發展

胰腺癌的發生是多個基因突變累積的結果。Yang等［8］發現，在腫瘤啟動突變(Kras突變和Trp53缺失)的背景下，抑制小鼠自噬更易發生胰腺腺泡導管化生和癌前病變——胰腺上皮內瘤變 (pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)，尚未癌變的細胞可能通過自噬清除作用減少DNA的損傷來維持細胞穩定。但自噬缺失引起的胰腺癌前病變向浸潤性癌進展的能力受損［9］，說明胰腺癌細胞形成后又需要通過自噬促進自身發展。

在腫瘤形成后細胞自噬被高度激活，是胰腺癌在體外和體內持續生長所必需的［10］。 Yang 等［8］觀察到胰腺癌細胞系中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Atg7的表達顯著升高。電子顯微鏡觀察也發現胰腺癌細胞中自噬體與溶酶體的融合過程。在異種移植和原位移植小鼠模型中觀察到，使用自噬抑制劑氯喹(CQ)治療可使Kras驅動的胰腺癌基因工程小鼠的存活率顯著提高。作者認為自噬水平提高是一種后天改變，并指出自噬通過阻止活性氧 (reactive oxygen species,ROS)毒性的積累，并提供物質維持氧化磷酸化來促進胰腺癌生長。

胰腺癌是一種高度纖維化、乏血供和結締組織過度增生的惡性腫瘤，其特征之一是間質細胞充斥。間質細胞自噬也促進了胰腺癌的發展。

胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell,PSC)是與胰腺癌細胞相互作用的主要基質細胞［11］。PSC可分泌細胞外基質分子和細胞因子。如白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)，增強腫瘤的侵襲性，與胰腺癌病人生存時間負相關，與疾病復發正相關。但PSC需從靜止狀態轉變為激活的肌成纖維細胞樣細胞才能發揮作用［11］。 Endo 等［12］發現，PSC 的激活與自噬相關。其認為是腫瘤微環境、胰腺癌細胞分泌的生長因子甚至PSC自分泌的IL-6因子參與促進PSC的自噬。抑制PSC自噬可通過改變腫瘤間質來降低胰腺癌侵襲性，但未降低其增殖性。Sousa等［13］的研究也證實PSC和腫瘤細胞在胰腺癌中的交叉作用。其中PSC需自噬來分泌丙氨酸，而腫瘤細胞吸收丙氨酸以支持其生長。Yang等［8］利用可調控細胞自噬相關基因(ATG4B)表達水平的小鼠模型，比較PSC和胰腺癌細胞自噬對腫瘤生長的相對貢獻，證實間質細胞自噬在腫瘤轉移植入中起主要作用，而在腫瘤細胞增殖中起次要作用。另有研究發現PSC可分泌一種胞外基質蛋白Lumican，后者可抑制癌細胞復制。其在早期抑制胰腺癌的生長［14］，在晚期胰腺癌中可增強其侵襲性［15］。 Li等［16］的研究表明，缺氧誘導PSC自噬。進而降解和降低PSC內蛋白質合成，使胰腺癌基質中的Lumican減少，說明胰腺癌間質細胞的自噬有助于胰腺癌早期的生存發展。但作者并未具體解釋其對晚期胰腺癌的影響。

成纖維細胞亦是胰腺癌微環境的重要組成部分［17］。腫瘤自噬間質模型的研究發現，胰腺癌細胞在癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblast,CAF)和其他基質細胞中誘導氧化應激，導致ROS過量產生［18-19］。過量的ROS生成會促使鄰近癌細胞產生抗氧化防御，保護其不被誘導凋亡。此外，過量的ROS具有旁觀者效應，使相鄰癌細胞中的DNA損傷，并呈現非整倍性DNA，兩者都是基因組不穩定的標志。最后，ROS誘導的氧化應激在腫瘤微環境中誘導自噬和線粒體自噬，導致含有營養物質(如酮和L-乳酸)的基質過量產生。這些可循環利用的營養物質或化學物質可促進癌細胞產生線粒體，從而促進癌細胞的合成代謝。較多的線粒體可維持腫瘤細胞的高代謝需求。該研究還表明，酮和乳酸有助于促進腫瘤生長和癌細胞轉移，并作為癌細胞的化學引誘劑。這與 Guo 等［20］的研究一致 。Zhang 等［21］胰腺癌細胞與CAF的研究指出，CAF對癌細胞的增殖無明顯的刺激作用，但阻斷CAF自噬可抑制癌細胞增殖，并提高胰腺癌細胞對化療的敏感性。

胰腺癌微環境中間質細胞被外界刺激或胰腺癌細胞影響誘導了自噬，并通過自噬產生細胞外基質、細胞因子、營養物質等，增強胰腺癌的侵襲性，也維持胰腺癌的增殖。間質細胞提供源源不斷的代謝物，也解釋了胰腺癌作為乏血供腫瘤的能量來源。

胰腺癌周圍組織中的自噬水平影響預后。Fujii等［22］在胰腺癌病人化療前的癌組織中，通過LC3免疫組織化學檢測觀察到自噬，并發現胰腺癌周圍組織強烈的LC3信號與病人預后不良呈正相關，提示這些區域中自噬的存在可能與癌癥進展有關。因此，提出胰腺癌自噬的臨床病理學意義，胰腺癌癌周組織LC3水平的高表達與預后差和無瘤生存期短高度相關。Yang等［10］也發現，胰腺癌轉移的淋巴結以及被浸潤的神經纖維中有高強度LC3染色。這些研究提示異常的自噬參與胰腺癌的發生、發展過程，甚至腫瘤的轉移，并可能影響胰腺癌的預后。

自噬對胰腺癌的增殖和侵襲有重要作用，且不局限于胰腺癌細胞。間質細胞、胰腺癌周圍組織、遠處淋巴結及神經纖維等都有自噬作用的參與。這表明自噬貫穿了胰腺癌的發生、發展，在胰腺癌中普遍存在，并起著關鍵作用。

二、自噬對胰腺癌的作用與腫瘤基因圖譜有關

胰腺癌的發生是多個突變累積的結果，涉及12條核心通路的改變［23］，但其基因突變序列幾乎恒定［24-25］。 其中 Kras基因的功能增益突變是第一個被觀察到的遺傳改變，95%以上的胰腺癌存在Kras突變。因此，Kras突變被認為是胰腺癌的起始基因病變。此外，約75%的p53突變和55%的SMAD4缺失發生在胰腺癌發展后期［24-26］，通常為雜合性突 變［27］。

許多研究都證明自噬的促進作用。但最近有學者發現自噬在某些情況下表現為抑癌作用。Rosenfeldt等［28］發現小鼠胰腺細胞Kras突變可使小鼠出現PanIN，并向胰腺癌發展。然而當敲除自噬相關基因Atg7或Atg5時，轉化限于PanIN-1和少量PanIN-2，形成PanIN-3和胰腺癌的過程受阻，表明Kras突變驅動的胰腺癌需自噬的參與。但Rosenfeldt等［28］發現小鼠胰腺細胞在Kras突變同時缺失p53的情況下，自噬的缺失并不會阻礙胰腺癌的發展，甚至加速疾病的發生。另外，使用自噬抑制劑羥氯喹治療小鼠，可顯著加快腫瘤形成。即在Kras驅動的胰腺癌中，p53正常時自噬促進腫瘤發生、發展，p53突變或缺失時自噬抑制腫瘤發展。PTEN是另一種抑癌基因，在胰腺癌中突變概率較低。Rosenfeldt等［29］的進一步研究發現，在PTEN基因缺失的動物中，自噬缺失(Atg7缺失)也未阻礙Kras驅動的胰腺腫瘤形成。且與自噬能力強的動物相比，自噬缺失更易因胰腺癌的形成而出現早期死亡。即PTEN的缺失與否，決定自噬對Kras驅動的胰腺癌是抑制作用還是促進作用。Rosenfeldt等［29］提出，自噬對腫瘤發展的作用由PTEN、p53或其他未知因素的狀態來決定，并對使用自噬抑制劑治療胰腺癌提出質疑。

考慮到Rosenfeldt等使用的是p53純合性缺失模型，而胰腺癌多為雜合性缺失［27］，Yang 等［9］培養了 3 種不同 p53 基因型(p53+/-、p53-/-和p53R172H/+)的小鼠胰腺癌細胞系。通過敲除Atg5或采用氯喹抑制自噬時，這3種細胞系的增殖均受到抑制。即無論p53是否發生突變或缺失，抑制自噬對腫瘤的生長均起到抑制作用。且羥氯喹還可有效抑制小鼠體內人胰腺癌移植瘤的生長。這些移植瘤均為Kras突變伴p53突變。對此作者提出，自噬抑制劑仍是一種值得研究的方法。出現不同結果可能是動物模型不同導致。

自噬與胰腺癌治療

目前胰腺癌仍以手術治療為主，術前和(或)術后放、化療為輔。主要的化療藥物是吉西他濱、氟尿嘧啶類藥物，包括卡培他濱、替吉奧以及氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸［5-FU/LV］)［30］。 自噬在胰腺癌的放、化療中起到不同的作用。

電離輻射可激活胰腺癌細胞自噬，并誘導自噬性死亡［31］。但許多研究發現自噬參與胰腺癌對輻射的抵抗［26,32-33］。其涉及的機制不同。 Wang等［32］發現，MicroRNA-23b表達下降會增加自噬相關蛋白Atg12，進而提高自噬水平。有55%的胰腺癌病人存在 SMAD4 缺失［26］。 Wang 等［26］發現，SMAD4 基因缺陷導致SMAD4蛋白減少，DNA損失修復機制降低，而誘導胰腺癌細胞ROS和自噬水平升高。Wu等［33］發現，lncRNA和HOX transcript antisense RNA(HOTAIR)通過上調Atg7的表達使胰腺癌細胞的自噬水平提高。有研究表明HOTAIR可競爭性結合miR-23b，使miR-23下調［34］。雖然其誘導自噬的機制不同，但增加的自噬都參與胰腺癌對輻射的抵抗。

許多一線的胰腺癌治療方案都涉及自噬相關細胞死亡，即Ⅱ型程序性死亡［6-7］。 Mukubou 等［31］研究表明，吉西他濱、紅外線電離輻射對胰腺癌細胞作用后，可激活其自噬，并誘導自噬作用來抑制癌癥。研究顯示吉西他濱和紅外線處理誘導自噬有協同作用，且自噬水平越高，細胞凋亡比例越高。并且，加入自噬抑制劑后，需更大劑量的吉西他濱才能取得與原來一樣的殺傷效果，這也表明自噬對胰腺癌細胞有殺傷作用。Pardo等［35］在若干胰腺癌來源的細胞系中也證實吉西他濱治療誘導VMP1介導的自噬，導致胰腺癌細胞凋亡。大麻素與吉西他濱具有協同作用，通過誘導ROS介導的自噬相關細胞死亡來抑制細胞生長，從而使耐藥胰腺癌細胞對吉西他濱敏感［36］。吉西他濱或5-FU可通過聯合奧美拉唑增強自噬活性、調節化療耐受，誘導胰腺癌細胞死亡［37］。

然而也有學者發現，自噬是胰腺癌細胞對化療藥物5-FU的重要耐藥機制。通過氯喹或溶酶體光損傷抑制自噬過程可增加對 5-FU 的敏感性［38］。 付志平等［39］的細胞實驗則表明吉西他濱誘導的自噬具有保護作用，且抑制自噬可激活凋亡特異性蛋白Caspase-3，引起Caspase依賴的細胞凋亡，從而增加胰腺癌SW1990細胞對吉西他濱的敏感性。這種差別可能與是否聯合用藥有關。

最近有報道，針對胰腺癌最常見的Kras突變信號通路的靶向藥曲美替尼誘導胰腺癌細胞自噬，聯合自噬抑制劑后效果優于胰腺癌一線化療方案。這是由于抑制RAS下游的ERK引起AMPK信號激活和m TORC1信號抑制。這兩種信 號 改 變 增 加 了自 噬［40-41］。

研究發現，放療誘導的自噬有助于保護胰腺癌細胞，使用自噬抑制劑削弱這種保護，可增加胰腺癌放射敏感性。但因為自噬的兩面性，聯合吉西他濱等以誘導胰腺癌自噬為殺傷機制的化療藥物，可增強胰腺癌自噬，導致胰腺癌細胞自噬相關死亡。臨床上放療必須和化療聯合。放療期間的同步化療，常用吉西他濱或氟尿嘧啶類藥物［30］。自噬抑制劑的選擇應具體情況具體分析。

自噬治療的悖論及可能的解決方案

自噬對胰腺癌的發生、發展有著極其復雜甚至矛盾的影響。在腫瘤未發生但有危險因素時，自噬有利于細胞穩定，減少異常大分子物質和受損細胞器如線粒體對DNA的損傷，即抑制腫瘤細胞的產生及異質性的形成。在腫瘤早期應用自噬抑制劑將促使胰腺細胞化生及早期腫瘤形成。在腫瘤進展期，因為腫瘤生長不受控制，加上放、化療的作用，使腫瘤細胞遭受饑餓、缺氧等情況，此時自噬作用將保護癌細胞。這個階段應用自噬抑制劑將使癌細胞不能利用自噬生存。本階段腫瘤間質細胞與腫瘤細胞面臨著同樣的環境，而腫瘤間質細胞的自噬為腫瘤細胞提供了營養物質以及有助于腫瘤轉移的微環境。這也是在本階段應用自噬抑制劑可能有助于增強抗腫瘤藥物作用的原因。因此，抑制腫瘤間質細胞自噬可阻止或逆轉腫瘤的生長及轉移。

自噬在胰腺癌中作用的復雜性歸納為以下幾點：①在自然情況下，胰腺癌中自噬的作用是支持胰腺癌細胞生存，促進轉移。②在化療藥等治療措施干預的情況下，由于自噬信號網中的個別通路被加強或抑制或與其他通路串擾，使自噬作用變得復雜，可支持細胞也可殺傷細胞。③誘導自噬是治療的普遍結果，但有的誘導癌細胞自噬死亡，而有的誘導自噬保護癌細胞。這可能是藥物誘導自噬的方式不同所引起，即取決于胰腺癌細胞的自噬是應激還是藥物主動誘導的。④微環境對胰腺癌的支持作用來源于自噬增強，即自噬抑制劑可能比自噬激活劑(即主動誘導自噬的化療藥物)應用更廣泛。⑤自噬抑制劑可能作為化療方案的輔料存在，而自噬激活劑則可能是聯合應用。因此，需關注幾個方面：①自噬抑制劑可能使胰腺化生；②自噬激活劑可能保護胰腺癌細胞；③自噬的作用可能由癌癥基因譜決定，不同基因圖譜作用可能完全相反。

Yang等［8］最近的研究表明，特異的自噬阻斷靶點ATG4B阻斷不會加速缺乏癌基因表達的胰腺細胞化生，即不會因為自噬的抑制導致早期腫瘤形成，這一定程度解決了自噬抑制治療的問題。自噬抑制在腫瘤起始突變 (Kras突變和Trp53缺失)的背景下，可導致上皮化生和癌前病變PanIN。在未表達致癌Kras的胰腺中抑制自噬，未觀察到胰腺組織化生。

另外，發現只針對胰腺癌細胞的治療并不能取得較好的療效，腫瘤間質在胰腺癌的發生、發展中亦起到重要作用。自噬對腫瘤進展的影響可能表現出明顯的環境依賴性。有數據表明，只有在營養豐富和缺乏應激刺激的情況下，依賴自噬的腫瘤才對體內自噬抑制劑有反應［42］。胰腺癌乏血供，多纖維增生，間質CAF是重要的細胞類型。但已有臨床試驗表明，減少纖維化除一線方案外并不利于病人［43］。因為靶向基質可能導致未分化和侵襲性胰腺癌，這可能是PSC異質性造成的［43］。這表明，減少CAF的治療并不是一個好選擇。更好的選擇可能是改變CAF與癌細胞之間相互作用方面。Zhang等［21］提出單純針對腫瘤間質細胞的自噬抑制劑能有效提高胰腺癌對化療藥物的敏感性。

Sathiyaseelan等［44］提出癌癥的自噬抑制策略需考慮環境的補償機制和(或)自噬的獨立效應。并提出，充分理解正常生理和疾病中大量的自噬、線粒體自噬和其他形式選擇性自噬調節劑是實施更精細乃至個性化自噬調節策略的基礎。

復雜性和展望

綜上所述，對細胞而言，自噬反應幾乎總是有益的，但當其發生在已開始惡性轉化的細胞中時，對宿主是有害的。最初，胰腺細胞因某些原因導致自噬缺陷，使健康的細胞獲得惡性特征。之后，一旦惡性腫瘤形成，在不利的微環境條件下，有效的自噬反應得以恢復并可能對支持癌細胞的增殖和生長至關重要。可見自噬水平在胰腺癌發生、發展的各過程產生不同的變化并起到不同的作用。

基于自噬對胰腺癌發生、發展的復雜影響及外界干預的機制不同，自噬在胰腺癌治療中亦起著復雜的作用。筆者提出一些建議：①由于基因圖譜可能影響自噬的作用，臨床上使用自噬抑制劑前可取活檢或標本明確胰腺癌細胞對自噬的實際依賴性。②對于抑制自噬可促進胰腺細胞化生這一可能的不良反應，研究發現腫瘤開始突變的情況下自噬抑制才有促進作用，且特異的自噬阻斷靶點ATG4B阻斷被證明不會促進缺乏癌基因表達的胰腺細胞化生［8］。間斷使用自噬抑制劑可在起到相同療效的同時減少對正常組織的作用［8］。③設計藥物使其不能通過血腦屏障，可降低藥物的神經毒性。④抑制胰腺癌間質細胞的自噬，既可抑制癌細胞生長，又可抑制轉移。⑤使用自噬抑制劑前應明確藥物的作用機制，若藥物殺傷機制主要是誘導自噬死亡，應避免使用自噬抑制劑。總之，探索特異自噬抑制劑，并闡明其與其他抗腫瘤藥物在胰腺癌中的相互作用機制，將為胰腺癌的臨床治療提供新的方法及思路。