飼用糞腸球菌EXW27 培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

郭建軍， 熊大維， 曾 靜， 魏國汶， 杜建華， 袁 林*

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌330096；2. 南昌工學(xué)院，江西南昌330108）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）又叫糞鏈球菌，是屬于腸球菌屬的一種兼性厭氧型乳酸菌，細胞呈圓形或橢圓形，成雙或短鏈狀排列，對環(huán)境適應(yīng)力和抵抗力強（張艷萍等，2016）， 可耐受四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素等多種抗生素，農(nóng)業(yè)部將糞腸球菌列入《飼料添加劑品種目錄（2013）》，適用于養(yǎng)殖動物（張娟等，2019）。糞腸球菌繁殖速度快、能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如細菌素、有機酸、抗菌肽等對腸道中的沙門氏菌、 大腸桿菌等致病菌具有良好的抑制作用（寶冠媛等，2015），激活腸道的免疫功能或刺激機體的免疫系統(tǒng) （Al Atya 等，2015）；糞腸球菌在動物消化道內(nèi)生長增殖過程中會產(chǎn)生活性物質(zhì)，如維生素和消化酶，能提高機體的消化功能，促進動物對飼料的利用，有效調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，促進動物生長，提高動物的生產(chǎn)性能（張群等，2016）。

影響菌株生產(chǎn)能力的因素不僅包括菌種本身的生理性能，還有外界合適的環(huán)境條件，所以通過優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件可改進發(fā)酵過程。 白文妹等（2017） 對金絲猴源益生糞腸球菌dlt7a 的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，活菌數(shù)可達5.883×109cfu/mL；焦月華等（2016）研究有氧呼吸條件下糞腸球菌LD33高密度增殖中發(fā)現(xiàn)， 在進行有氧呼吸代謝時能夠顯著提高糞腸球菌生物量和存活率； 但每種菌株的生長特性不同， 菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的繁殖力各異， 生產(chǎn)中需要針對每種菌株進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以提高菌株發(fā)酵的活菌數(shù)。本課題組從健康仔豬腸道黏膜上分離到一株具有良好益生特性和安全性糞腸球菌EXW27， 通過Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面試驗對該菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，提高其在發(fā)酵培養(yǎng)過程中的活菌數(shù)，確定高密度培養(yǎng)工藝， 以期為后期大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的微生態(tài)制劑奠定工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌株： 糞腸球菌EXW27 由本課題組從健康仔豬腸道黏膜上篩選得到， 具有優(yōu)良的益生潛力。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50 g、蛋白胨30 g、酵母粉9.0 g、 檸檬酸氫二銨3.5 g、K2HPO4·7H2O 3.75 g、NaAc·3H2O 6.25 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、MnSO4·H2O 0.45 g、組氨酸1.4 g、碳酸鈣10 g、去離子水定容至1000 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 菌種活化： 將保存的糞腸球菌EXW27 接種至MRS 斜面培養(yǎng)基上活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h， 連續(xù)轉(zhuǎn)接活化兩次； 再用接種環(huán)刮取兩環(huán)接種至液體MRS 培養(yǎng)基中， 于37 ℃、120 r/min 培養(yǎng)10 h 作為種子菌液。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)： 在三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基后滅菌，無菌條件下向三角瓶內(nèi)接入種子菌液；初始發(fā)酵培養(yǎng)條件為：250 mL 三角瓶裝100 mL 培養(yǎng)基，接種量5%，初始pH 6.8，37 ℃，150 r/min，搖瓶培養(yǎng)20 h。

活菌含量測定：計數(shù)方法采用固體MRS 傾注法，取100 μL 發(fā)酵液液加入900 μL 滅菌生理鹽水中，依次做10 倍稀釋，選取3 個適宜的連續(xù)稀釋倍數(shù)進行平板計數(shù)，每個稀釋度做3 個平行。

1.2.2 單因素試驗選取因素水平 本試驗對糞腸球菌發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速5 個因素進行了單因素試驗，分別設(shè)置了不同梯度， 通過測定發(fā)酵培養(yǎng)液的菌株EXW27 活菌含量選取最適的單因素水平。

1.2.3 Plackett-Burman 試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上， 選取可能影響糞腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)活菌含量的6 個因素：裝液量、初始pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、培養(yǎng)時間，采用Design-Expert 8.0.6 軟件的Plackett-Burman 試驗設(shè)計對上述因素進行研究， 篩選出其中對糞腸球菌發(fā)酵液活菌含量具有顯著性影響作用的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Burman 設(shè)計的各因素水平及效應(yīng)評價， 分析出影響腸球菌發(fā)酵液活菌含量關(guān)鍵因素， 并確定關(guān)鍵因子的爬坡方向和變化步長，進行最陡爬坡試驗，使關(guān)鍵因素濃度最大限度靠近響應(yīng)值極大區(qū)， 找出發(fā)酵液活菌含量的發(fā)酵條件，即為響應(yīng)面分析的中心點。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 由最陡爬坡試驗確定接近響應(yīng)面區(qū)域顯著因素的具體濃度， 利用Box-Bohnken（ BBD）與響應(yīng)面分析相結(jié)合，以糞腸球菌發(fā)酵液活菌含量作為響應(yīng)值， 以Plackett-Burman 試驗確定的3 個顯著因素為自變量， 以最陡爬坡試驗確定的因素最佳水平作為中心點進行3因素3 水平試驗，用DesignExpert 8.0.6 軟件通過試驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型， 最終確定最優(yōu)試驗條件。

1.2.6 驗證試驗 用所得到的最佳培養(yǎng)條件進行3 次平行試驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 糞腸球菌菌體生長曲線 以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值、pH 及活菌含量為縱坐標， 繪制糞腸球菌的生長曲線，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 糞腸球菌EXW27 生長曲線

由圖1 可知， 糞腸球菌在接種后0 ～5 h 處于遲滯期，菌體緩慢生長，此時，隨著菌體的生長，菌液的pH 開始下降，說明菌體發(fā)酵開始產(chǎn)酸；在6 ～14 h 處于對數(shù)生長時期，菌體生長迅速，同時pH 下降速率較慢， 說明在此時期菌體產(chǎn)酸較少；當(dāng)培養(yǎng)14 ～18 h，pH 趨于平穩(wěn)， 進入穩(wěn)定期，菌體生長速率保持平穩(wěn)。 18 h 之后，活菌含量出現(xiàn)下降，OD600nm值處于平穩(wěn)狀態(tài)， 但活菌含量開始緩慢減少，說明菌體生長進入到了衰亡期；在生長過程中pH 不斷降低， 說明整個過程在不斷的產(chǎn)酸，代謝物酸濃度累積到一定量時，開始抑制菌體生長，因此將優(yōu)化試驗的發(fā)酵時間設(shè)為18 h。

2.2 單因素試驗結(jié)果 不同因素對糞腸球菌活菌濃度的影響見表1。培養(yǎng)基中pH 會影響細胞代謝酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度， 進而影響微生物生長代謝。 起始pH 不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，糞腸球菌活菌數(shù)隨著初始pH 的升高， 呈現(xiàn)先增加后減少的總體趨勢，在初始pH 為7.0 時，活菌生物量最多； 不同接種量培養(yǎng)后活菌數(shù)存在較大的差異，當(dāng)接種量為6%時，菌體活菌含量明顯高于其他組；當(dāng)在不同溫度條件下培養(yǎng)18 h，發(fā)現(xiàn)在36 ℃培養(yǎng)時活菌含量達到最大值1.13×1010cfu/mL，這可能是由于溫度過低，酶活性受抑制， 酶促反應(yīng)遲緩， 導(dǎo)致菌體生長和代謝緩慢，但當(dāng)溫度過高時，抑制細菌的生長，甚至不利于菌株的存活。

表1 不同因素對糞腸球菌培養(yǎng)活菌濃度的影響

表2 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 Plackett-Burman 試驗方差分析

糞腸球菌是一種兼性厭氧的乳酸菌， 低的裝液量使得液體培養(yǎng)基中溶解氧升高，不適于菌體生長繁殖和代謝的要求。從表1 可以看出，在250 mL三角瓶中分別裝入60、90、120、150、180 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的變化過程中，乳酸菌活菌含量有一個明顯的先增加后減少的趨勢，當(dāng)裝液量為120 mL 時，活菌濃度達到最大值； 當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速由75 r/min 增加到200 r/min 時， 活菌含量先增加后下降， 當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min 時活菌含量達到最大值。

2.3 Plackett-Burman 試驗篩選發(fā)酵的重要因素在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵培養(yǎng)條件（初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間）分別作為PB 試驗設(shè)計中的6 個優(yōu)化因素A、B、C、D、E、F，選用n=14 的PB 試驗設(shè)計，每個因素分別取2 個水平，通過不同組合觀察發(fā)酵液中的EXW27 菌株活菌含量，結(jié)果見表2。PB 設(shè)計的各因素水平及效應(yīng)評價見表3，從表3 可以看出，在EXW27 菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中，初始pH、培養(yǎng)溫度、 搖床轉(zhuǎn)速對試驗結(jié)果的影響，P 均小于0.01，達到極顯著水平；試驗中模型的決定系數(shù)R2為95.94%，其校正后的決定系數(shù)R2adj為92.47%，不能由此模式解釋的基本不足10%， 結(jié)果可信。因此確定初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速作為下一步試驗的關(guān)鍵因素。 其他因素的取值可以根據(jù)各因素效應(yīng)的正負和大小，正效應(yīng)的因素取較高值，負效應(yīng)的因素取較低值。

2.4 最陡爬坡試驗結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果及顯著性分析結(jié)果， 設(shè)定3 個顯著性影響因素的方向與步長， 具體試驗設(shè)計及結(jié)果如表4。 由表4 可知， 第3 組發(fā)酵培養(yǎng)條件對應(yīng)的EXW27 菌株活菌含量為最高值， 故以初始pH 7.5、培養(yǎng)溫度38℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min（第3 組的條件）作為中心點，進行響應(yīng)面分析。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

2.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件 以初始pH 7.5、培養(yǎng)溫度38 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min 為影響因素，以菌株EXW27 活菌數(shù)（R）為響應(yīng)值，通過Design-Expert.8.0.6 的Box-Behnken 中 心 組 合 設(shè)計對菌株EXW27 的培養(yǎng)條件設(shè)計了3 因素3 水平試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA 分析， 各因素經(jīng)過擬合得到的二次多項式回歸模型方程為：

表5 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計與結(jié)果

該二次多項模型及其各項的方差分析結(jié)果見表6。 由表6 可以看出， 模型F 值=208.932，P ＜0.0001，說明該回歸方程是極顯著的；失擬項不顯著 （P=0.1759＞0.05）， 表明回歸方程具有顯著意義。回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=99.52%，說明該模型與實際情況擬合程度較好， 試驗設(shè)計可靠， 僅有0.48%的變異不能由此模型解釋， 故可以用該模型對菌株EXW27 不同培養(yǎng)條件下的生長情況進行分析和預(yù)測。

表6 回歸模型方差分析

為綜合考察交互項對菌株EXW27 活菌數(shù)的影響，對表2 數(shù)據(jù)進行回歸擬合和響應(yīng)面回歸分析繪出響應(yīng)面圖形，結(jié)果見圖2。 由圖2 可知，搖床轉(zhuǎn)速、初始pH、裝液量對菌株EXW27 活菌數(shù)影響均呈拋物面型關(guān)系， 且響應(yīng)面均存在一個極大值點，其中培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速之間的交互作用最為顯著，這一結(jié)果與回歸方程的交互項顯著性分析結(jié)果相符。 對回歸方程進行分析，得到各個因素的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH 7.74、培養(yǎng)溫度38.32 ℃、搖床轉(zhuǎn)速209.7 r/min， 在該條件下獲得的菌株EXW27 活菌數(shù)理論值為3.29×1010cfu/mL。

圖2 培養(yǎng)溫度、初始pH 及轉(zhuǎn)速對菌株EXW27 活菌數(shù)影響的等高線和響應(yīng)面圖

2.6 最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件的驗證 在預(yù)測出最佳工藝條件的基礎(chǔ)上， 考慮到實際操作中的簡便性等問題將該條件修正為：初始pH 7.7、培養(yǎng)溫度38.3 ℃、 裝液量120 mL/250 mL、 接種量6%、搖床轉(zhuǎn)速210 r/min、培養(yǎng)時間18 h，在此工藝條件下進行3 次平行試驗， 得到該乳酸菌菌株EXW27 活菌數(shù)為3.18×1010cfu/mL， 驗證值和模擬值較為接近， 說明采用響應(yīng)面法得到的該模型結(jié)果較為可靠， 擁有一定實用價值。 與初始發(fā)酵培養(yǎng)條件活菌數(shù)1.01×1010cfu/mL 相比，優(yōu)化后結(jié)果提高了3.14 倍。

3 結(jié)論與討論

因每種菌株的生長特性不同， 菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的繁殖力各異，這就要求在實際的生產(chǎn)中，針對不同的菌株優(yōu)化其培養(yǎng)條件。 響應(yīng)面法適合優(yōu)化影響因素較多且各因素間關(guān)系較復(fù)雜的工藝，與正交設(shè)計試驗相比，響應(yīng)面法優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，可以縮短試驗用時，并且可以篩選理論上的最佳發(fā)酵條件， 與正交法相比更精確。 周英等（2012） 采用正交法優(yōu)化的糞腸球菌F71 的最適pH 為9.0，最佳培養(yǎng)溫度為35 ℃，較初始提高了54.6%。 白文妹等（2017）確定金絲猴源益生糞腸球菌dlt7a 最佳培養(yǎng)條件為裝液量20%（50 mL/250 mL），接種量2%，培養(yǎng)基初始pH 6.5，在此條件下培養(yǎng)dlt7a 菌株， 活菌數(shù)可達5.88×109cfu/mL，比優(yōu)化前提高了46.53%。莫海燕等（2013）優(yōu)化的糞腸球菌ef-2 在最適初始pH 8.0，溫度34 ℃，裝液量20 mL/250 mL， 種齡20 h 等發(fā)酵條件下糞腸球菌的活菌數(shù)從初始的5.8×108cfu/mL 提高到6.7×109cfu/mL。 杜志琳等 （2015） 對糞腸球菌HEW-A152 的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化， 在種齡14 h，接種量5%，轉(zhuǎn)速120 r/min 等條件下發(fā)酵18 h 時HEW-A152 菌株活菌數(shù)達140×108cfu/mL。

本試驗結(jié)果表明， 菌株EXW27 最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：初始pH 7.7、培養(yǎng)溫度38.3℃、裝液量120 mL/250 mL、接種量6%、搖床轉(zhuǎn)速210 r/min、培養(yǎng)時間18 h，在此條件下，菌株EXW27 的活菌數(shù)為3.18×1010cfu/mL， 比優(yōu)化前提高了3 倍多。本試驗研究了糞腸球菌EXW27 的最佳培養(yǎng)條件，明確其發(fā)酵代謝途徑中的一些規(guī)律，可為其工業(yè)深層發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。關(guān)于該菌的中試發(fā)酵，有待于進一步研究。