不同酶制劑對豆粕中抗原蛋白的影響

龔阿瓊， 高 震， 陳敬幫， 戴晉軍， 胡駿鵬， 王學東

（1.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌443003；2.武漢輕工大學農產品加工與轉化湖北省重點實驗室，湖北武漢430023）

隨著飼料行業和畜禽養殖業的快速發展，豆粕作為大豆加工副產物，富含多種營養物質，其中蛋白質含量為40% ～50%， 脂肪為1% ～2%，碳水化合物約為10% ～15%， 且較魚粉價格低，是目前廣泛使用的植物性蛋白質飼料原料， 其需求量逐年遞增（熊智輝等，2007）。然而豆粕中含有的抗原蛋白，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等，會造成畜禽生產性能和飼料利用率降低， 這在一定程度上限制了其在飼料中的應用 （朱長生等，2014）。發酵法能在一定程度上去除豆粕中的有害物質或抗營養因子，提高其營養價值，但這會大幅度提高豆粕的使用成本（王章存等，2018）。隨著酶制劑工業的快速發展和各種酶制劑產品的問世，為利用酶制劑解決豆粕中的抗營養因子問題提供了可能性（姜倩倩等，2012）。王之盛等（2004）的體外酶解試驗表明， 蛋白酶對大豆蛋白的體外降解并不總是降低大豆蛋白生物學的致敏性， 大豆蛋白的降解具有蛋白酶特異性， 不同的蛋白酶作用于不同的大豆蛋白亞基或結構， 并最終反映到對動物的致敏性差異上（于海濤等，2018；陳乃松等，2008；王寶海等，2005）。 因此，本文使用常見的酶制劑采用單一和復合的方法對豆粕中的相應抗原蛋白開展試驗，測定其中抗原蛋白的水平，旨在為利用酶制劑體外處理豆粕中的抗原蛋白提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 豆粕，購自濱州萬齊飼料有限公司； 大豆球蛋白定量檢測試劑盒、β-伴大豆球蛋白定量檢測試劑盒， 購自北京龍科方舟生物工程技術有限公司。

堿性蛋白酶1 ～3，購自山東蔚藍生物科技有限公司；堿性蛋白酶4 ～6，購自寧夏夏盛實業集團有限公司；堿性蛋白酶7 ～11，購自安琪酵母股份有限公司。 中性蛋白酶1 ～2，購自山東蔚藍生物科技有限公司；中性蛋白酶3 ～5，購自安琪酵母股份有限公司。 酸性蛋白酶1 ～2，購自山東蔚藍生物科技有限公司；酸性蛋白酶3 ～4，購自安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解豆粕方法 根據飼料采樣GB/T14699.1-2005 對購買豆粕進行分裝采樣， 在每個呼吸袋裝入200 g 豆粕， 按照料水比5：4 加入一定體積蒸餾水， 在25 ℃條件下再加入0.5%的酶制劑，處理24 h 后，將呼吸袋打開，濕物料攪拌均勻取樣備用，測定其中抗原蛋白含量。

1.2.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的測定ELISA 測定過程參照產品說明書進行。 過程簡要描述如下：稱取一定質量備用樣品（樣品需粉碎成60 目以上顆粒，0.3 g） 于50 mL 離心管中， 加入30 mL 樣品提取液，于25 ℃振蕩提取16 h，靜置2 min 后，離心5 min（4000 r/min），取上清液并稀釋70 倍。 將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品平行測定兩次， 記錄校準孔和樣品孔所在的位置，經過加樣、洗板、加酶標試劑、顯色，加終止液后于450/630 nm 雙波下讀取吸光度值。 按照下列公式計算吸光率：

式中：B 為校準品2 ～6 或樣品的平均吸光度值，B0為校準品1 的平均吸光度值。

校準曲線的繪制：以校準品百分吸光率為縱坐標，以校準品濃度的對數為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3 試驗設計 采用對比試驗方法，在實驗室進行體外消化試驗： 在恒溫振蕩器上進行反應（37 ℃，90 min，100 r/min），反應結束后立即瞬間高溫滅活終止酶解反應，烘干后測定相關的抗營養因子。

1.2.4 數據處理 抗原蛋白降解率計算公式如下：

抗原蛋白降解率/%=（對照組豆粕與酶解豆粕的差值）/對照組豆粕×100。

2 結果與分析

2.1 酶制劑的篩選

2.1.1 堿性蛋白酶 由圖1 可知， 在相同的酶解參數（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，不同堿性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的含量影響差異較大，10 號酶對兩種抗原蛋白都有效果， 對大豆球蛋白降解效果更明顯。

圖1 不同堿性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.1.2 中性蛋白酶 由圖2 可知， 在相同的酶解參數（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，不同中性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的含量有一定差異性，5 號酶對大豆球蛋白降解效果優于伴大豆球蛋白。

圖2 中性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.1.3 酸性蛋白酶 由圖3 可知，在相同的酶解參數（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，不同酸性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的含量影響差異相對不大，4 號酶對伴大豆球蛋白降解效果較好。

圖3 酸性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.2 酶添加量的選擇

2.2.1 堿性蛋白酶用量 由圖4 可知，在相同的酶解參數（料水比、溫度和處理時間）下，隨著堿性蛋白酶（10 號）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在堿性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來越低。 在0.7%添加量時達到最高降解率。

圖4 不同添加量的堿性蛋白酶對大豆球蛋白的降解效果

2.2.2 中性蛋白酶用量 由圖5 可知，在相同的酶解參數（料水比、溫度和處理時間）下，隨著中性蛋白酶（5 號）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在中性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來越低。在曲線的開始階段，斜率最大，此后逐漸減小，表明隨著中性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐漸減小。

圖5 不同添加量的中性蛋白酶對大豆球蛋白的降解效果

2.2.3 酸性蛋白酶用量 由圖6 可知，在相同的酶解參數（料水比、溫度和處理時間）下，隨著酸性蛋白酶（4 號）量的增加，豆粕中的β-伴大豆球蛋白降解率增大，表明在酸性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來越低。在0.6%添加量之后逐漸減小，表明隨著酸性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐漸減小。

圖6 不同添加量的酸性蛋白酶對β-伴大豆球蛋白的降解效果

2.3 復合酶的制備 優選10 號堿性蛋白酶、5 號中性蛋白酶和4 號酸性蛋白酶按照7:5:6 比例制備復合酶。 由圖7 可知，在相同的酶解參數（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，復合酶對抗原蛋白的降解效果優于單個酶。

圖7 不同酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

3 結論

豆粕是畜牧行業中優質蛋白質來源之一，但豆粕中的抗原蛋白是普通存在的問題。 酶解法被認為是安全有效可降低抗原蛋白的方法， 于海濤等（2018）的試驗表明，使用6 kg/t 的角蛋白酶可以降解60%的伴大豆球蛋白和37%的大豆球蛋白，本文通過篩選不同外源酶試驗，也得出不同酶制劑對豆粕中抗原蛋白有不同程度的降解作用，說明酶解法確實是去除抗原蛋白的有效方法。 推測抗原蛋白類物質以復雜的連接方式形成復合體，單一的酶制劑難以充分破壞其結構，因此多種酶制劑的協同作用效果可能更好， 本文也驗證了這一推測，在同樣的酶解方法下，復合酶制劑對豆粕中抗原蛋白降解效果優于單一酶制劑。 通過抗原蛋白的降解率分析， 使用外源酶可有效提高豆粕中的蛋白消化利用率， 但是酶解法的酶解效果受酶的種類、 添加量、 酶解條件等多種因素的影響。王之盛等（2004）認為，還需要考慮不同酸堿性條件對酶解能力的影響， 并通過試驗驗證在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解。 因此如何有效降低或者完全去除豆粕中的抗原蛋白， 還需在酶解方法上做更深入的研究。