23份豌豆材料過氧化物酶同工酶研究

王翠玲， 楊曉明, 王旺田， 周衛東

(1. 甘肅農業大學生命科學技術學院 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室， 蘭州 730070；2. 甘肅省農業科學院糧食作物研究所， 蘭州 730070， 3. 蘭州現代職業學院 農林分院， 蘭州 730070)

豌豆(PisumsativumL.)屬豆科，蝶型花亞科，一年生或越年生攀援性草本植物，兼有蔬菜、糧食、飼料功能，是世界第二大食用豆類作物，豌豆適應能力很強，在全世界范圍內有廣泛的地理分布，多樣化的生長條件形成了豌豆的遺傳多樣性[1]。豌豆還具有良好的固氮性能，能夠改善土壤氮肥供應，在草地農業生態系統中發揮著非常重要的作用[2-3]。世界各地區都十分重視對豌豆種質資源的研究，對其種質資源進行收集、利用和保存[4]。中國地域廣闊，豌豆資源比較豐富，其收集和研究開始于20世紀60年代，目前國家種質資源庫中已保存豌豆資源5000余份[5]。豌豆種質資源的研究，可以豐富我國豌豆遺傳資源基因庫，提高豌豆抗逆性、抗病性研究，加快豌豆新品種培育的步伐[1，4，6]。

過氧化物酶(peroxidase, POD)是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系。過氧化物酶同工酶酶譜的差異能夠反映基因所處的遺傳背景差異[7-9]。宋志文等[10]利用過氧化物酶同工酶研究中國東北地區野豌豆屬植物；張建全等[11]對4個春箭舌豌豆品系原種及第3代過氧化物酶同工酶分析，探討F3代農藝性狀等發生變化的遺傳機制。本研究擬對23個豌豆種質資源的過氧化物同工酶表達進行分析，結合豌豆種子形態特征，為豌豆的遺傳多樣性分析以及新品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

由甘肅省農科院隨機抽取國內外不同地理來源豌豆材料23份。中國品種資源20份，分別來自西藏(3份)、甘肅(2份)、陜西(5份)、四川(4份)、內蒙古 (2份)、云南(1份)、臺灣(1份)、寧夏 (2份)；國外品種資源3份，來自澳大利亞(3份)。各材料編號特征見表1。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發培養及酶液的提取

23份豌豆材料各選取成熟飽滿的種子8～10粒浸泡，萌發，每天早晚各換MS營養液2次，14 d后，取各豌豆的根0.5 g洗凈，于預冷的研缽中，加入樣品提取液5 mL，研成勻漿，16 000 r/min離心10 min，取上清液，即酶液，備用。

1.2.2 酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳[12]

采用聚丙烯酰胺垂直平板電泳。濃縮膠T=3.5%，分離膠T=7.5%，電極緩沖液pH 8.3，將酶液與樣品處理液1∶1混合，每空加樣15 μL，起始電壓110 V，分離膠電壓200 V，電泳至溴酚藍下沿1 cm左右處停止。

1.2.3 過氧化物同工酶酶染色

電泳結束后，剝膠，采用醋酸聯苯胺法進行染色，具體步驟為：將蒸餾水漂洗過的凝膠放入POD染色液中，震蕩5 min待酶帶顯出后，用蒸餾水漂洗，拍照繪圖分析。

1.2.4 數據分析

依據電泳照片，記錄數據，采用美國UVP凝膠成像分析系統求出相對遷移率，計算相似系數和不相似系數。酶帶的相對遷移率(Rf)=酶帶的遷移距離/溴酚藍的遷移距離；過氧化物酶同工酶酶譜間相似系數c=2w/(a+b)，其中c為酶譜間相似系數，w為A和B兩個種相同的酶帶數，a為種A在酶譜中的酶帶數，b為種B在酶譜中的酶帶數。采用SPSS23.0軟件對 23份豌豆材料的親緣關系及遺傳差異進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同豌豆材料幼苗根部過氧化物酶酶譜特征

23份供試豌豆材料根部過氧化物酶同工酶酶譜和酶譜模式見圖1和圖2。從圖1和圖2中可以看出：各豌豆材料過氧化物同工酶在酶帶數、酶量、相對遷移率等方面存在差異，有的位點上出現穩定一致的酶帶，有的位點呈現很強的特異性。供試材料中共出現161條酶帶，酶帶類型為14種，酶帶最多是8條酶帶，最少是5條酶帶，有8條、7條酶帶的材料為多數，少數材料酶帶為6條或5條，表明23個供試豌豆材料具有較豐富的遺傳多樣性。

根據酶譜特征，從負極到正極按相對遷移率Rf可把它們分成3個區，即A、B、C 3個區域，A區是近陰極端的慢速遷移區，Rf=0.13～0.21，有3種類型酶帶，23個豌豆材料在A區共有酶帶P1，Rf=0.13。B區為中速遷移區，Rf=0.37～0.51，有4種類型酶帶，在B區，23號有1條酶帶，其余材料有2條酶帶；在B區的共有帶為P4，Rf=0.37。A區與B區各品種P1、P4的染色程度不一樣，說明不同材料的酶活性差異較大，酶帶染色最深為1、2、6、11、12、13、15及19號材料，而8、10、14號材料的染色最淺。C區為近陽極端的快速遷移區，Rf=0.62～0.83，有7種類型酶帶，不同材料的酶帶數有2到4條不等，C 區的沒有公共帶，C區的酶帶數、酶量在不同豌豆品種間有差異較大，在染色程度上表現非常明顯，但也一些比較接近，如12和13號材料。

表1 23份豌豆材料編號

圖1 23份豌豆材料豌豆幼苗根過氧化物酶同工酶電泳圖譜

Figure 1 The electrophoretogram of POD isozymes in the roots of 23 cultivars ofPisumsativumL.

2.2 不同豌豆材料過氧化物酶同工酶聚類分析

親緣關系分析聚類分析是用數學方法將一批樣品(變量)按其性質的親疏遠近程度進行分類的科學方法，用酶譜間相似系數(similarity coefficient) 的大小表示分類群親緣關系的遠近，酶譜相似系數等于2個分類群中相同的酶帶總數除以2個分類群中酶帶總數。相似系數在0～1之間，親緣關系越近的種類，相似系數越接近于1，彼此無關的種類，其相似系數越接近于0。利用各品種所具有的酶帶數計算出相似系數c，各個種源間的遺傳相似度在0.33～1.00之間，說明不同種源的豌豆種子間有不同程度的遺傳差異。

圖2 23份豌豆材料根過氧化物酶同工酶酶譜模式圖

采用SPSS23.0軟件對23份豌豆材料的親緣關系及遺傳差異進行聚類分析，結果見圖3。當取不同閾值時聚成不同類，若取0.5時，供試豌豆材料可聚為5類，分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。第Ⅰ類為1、2號材料，都來源于中國西藏，全國統一編號為G0004526和G0004548，品種名都為豌豆；粒形為球形，但種皮表面有差異，1號種皮凹坑，2號光滑。第Ⅱ類為3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17號材料，共14分材料，分別來源于中國甘肅(2份)、中國陜西(5份)、中國四川(3份)、中國內蒙古 (2份)、中國云南(1份)、中國寧夏 (1份)。從品種來看，以麻豌豆居多，有 8個品種為麻豌豆，小麻豌豆、大麻豌豆、青麻豌豆、青豌豆各1份，2份豌豆。其中3號與17號材料、8號與16號材料、12號與13號材料親緣關系相互最近，相似系數為1。第Ⅲ類為18、19、20、21、23號材料，其中18為來自中國四川的白豌豆，全國統一編號是G0005571；19號為來自中國臺灣的臺中11(莢豌豆)；20號是來自中國寧夏的藍豆，粒形為扁形；21和23號都來自于澳大利亞。第Ⅳ類為22號材料，自于澳大利亞的品種JI.1089，單獨一類。6號材料也單獨聚為一類，為第Ⅴ類，來自中國西藏的麻豌豆G0004524，粒形扁形，光滑，粒色紫黑，不同于其他材料。從聚類圖來看，6號材料與其他材料的親緣關系較遠。

3 討論

遺傳多樣性的表達主要是通過對遺傳多態性的標記來反映的，可通過某個表型特征、特異的DNA片段或特異的同工酶帶型及蛋白質作為目的基因直接或間接的標記，來研究基因的變異和遺傳規律[13]。豌豆種質資源遺傳多樣性研究起步較晚，目前有關豌豆種質資源的遺傳多樣性研究主要通過相關田間農藝性狀的調查來實現[14-15]。自1959年Market首次提出了同工酶的概念以來，有關同工酶的研究就很快發展起來。過氧化物酶也可以用來推測各分類群之間的親緣關系，進行遺傳多態性分析。本研究23份供試豌豆材料過氧化物酶同工酶圖譜在酶帶數、酶帶濃度、酶帶顏色深淺、擴散程度及遷移率上都有明顯差別。對過氧化物酶同工酶酶譜分析，由負極向正極可分為A、B、C 3個區域，分離出161條酶帶，酶帶類型為14種，酶帶最多是8條酶帶，最少是5條酶帶，A區和B區各有一條共有表達酶帶，C區Rf=0.62～0.83，有7種類型酶帶，沒有共有酶帶，但C區的酶帶數、酶帶顏色深淺變化豐富，表現出較強的多態性。23份材料中有兩條共有酶帶，又有各自的特征酶帶，既顯示出豌豆物種具有一定程度的遺傳穩定性，也蘊涵著豐富的區域差異性及遺傳多樣性。

圖3 23份豌豆材料同工酶酶譜性狀聚類圖

酶譜相似系數計算所得23份供試豌豆材料間的遺傳相似度在0.33～1.00之間，聚類分析結果表明：1、2號豌豆材料聚為一類，都來自于中國西藏，比較1、2號材料的酶譜，A區、B區酶譜特征幾乎一樣、C區2號材料少了一條酶帶。來自于中國6個省和自治區的麻豌豆系列聚為一大類，其中3號與17號材料、8號與16號材料、12號與13號材料相互間的親緣關系最近，酶帶幾乎一樣，相似系數為1。來自于中國四川的白豌豆，中國寧夏的藍豆，中國臺灣的臺中11(莢豌豆)，澳大利亞的IFPI 3917、CRIMSON ROSE聚為一大類。來自于澳大利亞的品種JI.1089，單獨一類； 6號材料中國西藏麻豌豆G0004524，也單獨聚為一類，其酶帶數較少，為6條，與其他材料的親緣關系最遠。以上結果表明豌豆過氧化物酶同工酶與品種有關系，如大多數麻豌豆系列聚為一大類；也與其地理分布有著很大的關系。曾亮用ISSR標記技術對來自國內外的73份豌豆材料進行遺傳多樣性分析，基本符合地理來源相近的材料聚為一類，呈現出一定的地域性分布規律；曾亮還對120份豌豆材料的20個表型性狀分析，表明豌豆屬植物種質資源形態變異十分豐富，國內和國外群體內差異顯著[6]。本研究中豌豆分類與豌豆品種的粒形顏色有關，如來源于中國西藏的麻豌豆，粒形扁球、光滑、紫黑，不同于其他麻豌豆，其親緣關系與其它材料較遠，單獨為一類。李紅等在對不同苜蓿品種過氧化物酶同工酶的分析中也得出，品種間的地理位置越近，同工酶也就越相似，酶譜的相似程度也就越高，相反則低，可以根據同工酶的差異來對品種進行分類[16]。劉賀賀等應用POD同工酶分析75份蕨麻材料的遺傳多樣性，結果與形態學標記、細胞水平、分子標記研究的結果一致[17]。利用過氧化物酶同工酶來探討種質遺傳關系，具有周期短、成本低、操作簡便等優勢。本研究的不足之處是所選用的材料較少，如果能與形態學、細胞學等研究相結合，分類會更準確。

總之，本試驗的23份材料過氧化物酶同工酶酶譜分析結果表明：供試材料在同工酶系統中均表現出一些明顯的共同特征譜帶，顯示出豌豆物種具有一定程度的遺傳穩定性，同時各材料的同工酶酶譜之間也表現出某些明顯的差異性，體現出豌豆物種蘊涵著豐富的區域差異性及遺傳多樣性，為豌豆進化、分類、種質資源的保存及利用奠定基礎。