Ganoderma sp. X1固態發酵改善酒糟品質

裴久文， 方 勇， 高學志， 謝國排， 房 偉， 方澤民

(1. 安徽大學 生命科學學院， 合肥 230601； 2. 現代生物制造安徽省重點實驗室， 合肥 230601；3. 安徽省微生物與生物催化工程研究中心， 合肥 230601； 4. 阜陽市畜禽養殖服務中心， 阜陽 236012)

飼料是養殖業的基礎支撐，也是動物性食品安全的源頭。雖然我國飼料市場發展前景廣闊，但是蛋白飼料資源依然短缺，自給自足率不足50%，每年需從國外進口大量豆粕、魚粉等以填補國內市場的不足[1]。為了解決我國蛋白質飼料資源不足的問題，除了要充分開發利用常規蛋白飼料資源，還要充分挖掘我國大量的非常規飼料資源，如酒糟、醋糟、醬渣、秸稈、工業廢棄物等[2]。而采用現代生物技術開發利用非常規飼料資源，能夠使其中的抗營養因子鈍化或脫毒，同時提高可利用營養物質的含量，提升飼料的適口性和消化率[2]。

白酒糟渣是一類重要的非常規飼料資源，占全國年生產各類糟渣的70%以上。根據國家統計局公布數據，2017年我國白酒產量約為1198萬t，酒糟的年產約為3594萬t。由于白酒糟酸度高、水分高，量大而集中，如不及時加以處理，極易腐敗變質，造成環境污染。目前，國內白酒產業對白酒糟最為普遍的處理方式是作為飼料行業的原料或基質，一般經干燥脫水甚至直接打包出售，附加值較低。

近年來，將白酒糟作為發酵基質，通過微生物發酵生產蛋白飼料是酒糟飼料化的研究熱點，也是實現糟渣再利用的經濟可行的方法之一[3]。然而，在現有工藝中，酒糟木質素未能得到有效降解。白酒糟中的木質素約占13%～18%，主要來自于發酵過程中添加的稻谷殼(約占干酒糟的40%～50%)[4-5]。由于木質素不能被瘤胃微生物所分解，限制了反芻動物對酒糟類飼料的高效利用。因此，木質素使酒糟飼料的消化率及飼用價值降低，成為飼料中的抗營養因子。在酒糟高蛋白飼料生產中，添加木質素降解菌，降解其中的抗營養因子——木質素，使與木質素交聯的細胞壁多糖游離出來，同時釋放細胞壁內可利用營養物質，是提高酒糟飼料利用效率的有效途徑。

自然界中，白腐真菌(White-rot fungi)是已知的能夠有效降解木質素的一類真菌，能通過分泌木質素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase)等木質素降解酶，在分子氧的參與下，依靠自身形成的H2O2，觸發一系列自由基反應，實現對木質素無特異性的氧化分解[6-8]。已有研究報道，白腐真菌應用于生物降解秸稈木質素以協同發酵生產飼料，包括Pleurotusostreatus[9-10]，Lentinulaedodes[11-12]，Phanerochaetechrysosporium[13]等。以白酒糟為基質，目前僅有白腐真菌Phanerochaetechrysosporium被用以降解白酒糟木質素[4]。Ganodermasp.真菌是自然界木質素的有效分解者，可表達多種木質素降解相關酶[14]，在木質素降解方面具有重要的應用價值。本研究采用Ganodermasp. X1固態發酵白酒糟，優化降解條件，以高效降解酒糟中的木質素，提高粗蛋白的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

Ganodermasp. X1為本實驗室從枯木中分離篩選到的一株漆酶高產菌株。白酒糟由安徽金種子酒業股份有限公司提供，主要成分為高粱、稻殼。

YMG培養基(1 L)：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1Ganodermasp. X1生長最適pH值

配制YMG平板，滅菌前配制含200 mL YMG的培養液的500 mL三角瓶，調節液態YMG的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待溫度適中，倒平板。在同一個培養平板上取1 cm2左右的菌塊，接種至不同pH值平板上，每個pH值梯度3個重復，28 ℃恒溫培養箱培養6 d，每天記錄菌絲生長直徑。

1.2.2 固態發酵培養基制備

從工廠取得新鮮酒糟，85 ℃恒溫烘干至恒重，稱取(10±0.05)g干酒糟至100 mL三角瓶中，按照固態發酵正交試驗設計，用pH 6.5磷酸鹽緩沖液調節培養基pH值及含水量，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后備用。

1.2.3Ganodermasp. X1酒糟固態發酵

明確Ganodermasp. X1最適生長pH值后，采用L9(33)正交試驗(表1)進行固態發酵，一共9組，每組3個重復。按照實驗設計進行接種，恒溫箱靜置培養。

表1 固態發酵正交試驗設計

1.2.4 發酵后成分檢測

酒糟固態發酵后，發酵產物烘干稱重，檢測粗蛋白、纖維素、木質素的含量，參照參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[15]。

1.2.5 發酵產物選擇性指數分析

發酵后，以木質素和纖維素失重的比值(選擇性指數，SF)作為依據，進行木質素降解最適條件的分析[16]，SF值越大，表明降解木質素保留纖維素效果越好。

采用Excel對數據進行處理，SPSS17.0對數據進行分析并結合Duncan法進行多重比較顯著性差異分析。

1.2.6 麩皮添加對酒糟發酵的影響

發酵培養基的干重為10 g，其中酒糟與麩皮的比例分別為8∶2～3∶7，加入烘干的100 mL三角瓶中進行固態發酵，發酵條件為培養基含水量75%，溫度28 ℃，接種量10%，發酵產物的檢測方法同1.2.4和1.2.5。

1.2.7 飼料感官性質分析

根據《青貯飼料質量評定標準》評判飼料感官性質[17]，包括發酵產物的氣味、手感、顏色和有無變質等感官指標，劣等品質，腐爛的氣味，色澤是黑褐色，質地粘結成塊；一般品質，刺鼻酒酸味，暗褐色，質地略帶黏性；良好品質，淡酸味，褐黃色，質地不粘手；優等品質，甘酸香味，聞著舒適，亮黃色，質地松散軟弱，不粘手。

2 結果與分析

2.1 Ganoderma sp. X1最適生長pH值

從生長趨勢可知，培養基pH 6時，Ganodermasp. X1生長速度最快(圖1)。許多白腐真菌偏好在pH 4.0～5.0的微酸性的環境下生長[18]，但也存在pH 7.0～9.0生長的白腐真菌[19]。因此，不同菌種適宜的生長環境不盡相同。固體培養基在滅菌的過程中pH會降低0.5～1.0，因此選擇pH 6.5的緩沖液調節固態發酵培養基pH值。

圖1 Ganoderma sp. X1生長最適pH值

2.2 固態發酵產物成分測定

測定固態發酵產物基本成分含量可知，木質素含量隨著發酵時間的延長而減少，表明Ganodermasp. X1可以有效降解木質素，其中第7組木質素降解率最高，達到47.10%(圖2-a)。纖維素的含量隨著發酵時間的延長而減少(圖2-b)，表明Ganodermasp. X1可以有效降解纖維素，其中第4組纖維素降解最高，達到29.81%，而第7組纖維素降解最低，達到13.55%，說明第7組發酵條件能夠很好地保存纖維素，減少營養成分的損失。粗蛋白的含量隨著發酵時間的延長而增加(圖2-c)，其中第7組發酵15天的增加量最高，達到1.34 g，粗蛋白含量增加至17.30%。

2.3 選擇性指數分析

酒糟的微生物固態發酵一方面要求高效降解木質素，另一方面要求能夠盡可能保存其中纖維素，即選擇性指數(SF)高[16]。因此，對發酵15 d的酒糟產物的SF值進行了分析。結果表明，不同發酵條件下木質素降解和纖維素的消耗存在很大差異。由表3可知，第7組發酵條件獲得的發酵產物的SF值最高，是較優的發酵條件。通過單因素不同水平的比較，可知采用含水量75%的固態培養基質，以10%接種量，28 ℃培養15 d，木質素降解率均最高。

a木質素Lignin;b纖維素Cellulose;c粗蛋白Crude protein

圖2固態發酵后不同時間的產物成分含量
Figure 2 The fermented products in distiller grains after fermentation different time

表3 SF的測定結果

注：SF是木質素/纖維素的比值，SF值越大，表明降解木質素保留纖維素效果越好

2.4 顯著性分析

對木質素的降解率的影響因素進行極差法分析(表4)。在接種量、含水量和溫度單因素影響下，SF值的極差值R分別為0.71、0.56和0.99，即三因素對木質素降解的影響程度為溫度>接種量>含水量。然而，接種量、含水量和溫度對SF值影響差異不顯著(P>0.05)。通過單因素不同水平比較，10%接種量、75%含水量、28 ℃為較好的發酵條件，得出第7組是最優的發酵條件。

2.5 固態發酵培養基酒糟與麩皮配比優化

2.5.1 發酵產物木質素、纖維素及粗蛋白含量測定

采用酒糟與麩皮5∶5配比的固態培養基質，發酵10 d，木質素的降解率最高，達到46.36%(圖3-a)，纖維素的降解率最大，達到50.52%(圖3-b)。隨著發酵時間的延長，粗蛋白含量呈增加的趨勢(圖3-c)。采用酒糟與麩皮5∶5比例的固態培養基質，粗蛋白含量增加最快，發酵10 d達到最高，從初始的1.39 g增加到1.64 g，粗蛋白含量增加至24.80%，較僅以酒糟為培養基質的發酵產物的粗蛋白含量(17.30%)有較大提升。因此，以酒糟與麩皮為培養基質進行固態發酵，能夠有效的提高粗蛋白的含量，同時縮短發酵時間。

表4 選擇性指數顯著性分析

注：同一列據肩標含不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.5.2 不同培養基配比發酵產物SF值分析

固態發酵10 d后，由表5中SF值可以看出酒糟和麩皮3∶7的SF值最高，其次是5∶5的比例。說明Ganodermasp. X1在這兩個比例中有較好的木質素降解能力。但5∶5的比例木質素有最高降解率，而且粗蛋白的含量增加最高，因此選擇酒糟與麩皮5∶5的配比作為最適的發酵培養基。

a木質素Lignin;b纖維素Cellulose;c粗蛋白Crude protein

圖3酒糟與麩皮配比優化后的發酵產物成分含量

Figure 3 The fermented producs in the distiller grains after optinization of the ratio of distiller grains and to wheat bran

表5 SF的測定結果

1、4：發酵前；2、5：發酵5 d；3、6：發酵10 d

圖4發酵前后酒糟的形態

Figure 4 Changes in the state of the distillers grains

2.6 發酵前后酒糟感官評價

發酵前后固態培養基形態參考《青貯飼料質量評定標準》評價，原始狀態的干酒糟有刺鼻酒酸味，色澤為黑褐色，質地粘結成塊，為一般品質(圖4)。當發酵至第5天時，培養基中菌絲大量生長，淡酸味、褐黃色、略帶黏性，為較好品質；發酵至第10天時，菌絲聚集形成厚厚的菌質體，打開紗布，會聞到淡淡的清香味，酒糟呈亮黃色，質地松軟，為良好品質。這說明當酒糟與麩皮的比例適當，會加快菌絲的生長，同時會產生菌質體，改善酒糟的品質。

3 討論與結論

靈芝是一類重要的白腐真菌，其對木質素的利用強于對纖維素和半纖維素的利用。靈芝可胞外分泌多種木質素分解酶，包括LiP、MnP和laccase，將木質素等分解為小分子的單糖或雙糖[20]。另一方面，靈芝能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、以及纖維素分解酶等其他酶系，這些酶可能在靈芝降解木質素過程中直接或間接地發揮作用[21]。以靈芝為發酵菌株，固態發酵玉米秸稈、稻草等農業廢棄物，降解其中木質素，是此類資源利用的有效途徑。孫芹英等[22]用靈芝固態發酵產漆酶及對秸稈木質素的降解中，在發酵30 d時,玉米秸稈的木質素降解率最大，達到23.7%，油菜秸稈也達到了16.2%。Shrivastava等[23]用靈芝固態發酵秸稈制備反芻動物飼料，在發酵15 d后，酸性洗滌纖維素含量、中性洗滌纖維素含量和半纖維素的含量分別降至24.77%，31.03%和42.51%，且秸稈木質素含量降低34.95%。

本研究中，采用具有Ganodermasp. X1固態發酵白酒糟，降解酒糟中的木質素，發酵15 d木質素的降解率可達47.10%，且粗蛋白達到17.30%。由此推測，Ganodermasp. X1可能分泌木質素降解相關酶，部分分解酒糟中的木質素，其降解周期及效率高于黃孢原毛平革菌對白酒糟木質素的降解[24]。另一方面，靈芝菌體生物活性成分多樣，含有多糖類、萜類、生物堿類、氨基酸蛋白質類等多種成分[25]。因此Ganodermasp. X1發酵白酒糟后能夠有效提升發酵產物粗蛋白含量，并且菌種在代謝過程中可能產生多種活性成分,豐富發酵飼料的營養。

麩皮是一類重要的農副產品，其可有效地誘導白腐真菌中相關木質素降解酶的產生[25]。將麩皮與酒糟配比后作為固態發酵基質，發酵10 d，木質素降解率可達46.36%，且粗蛋白含量提升至24.80%。因此采用麩皮白酒糟混合基質發酵，能夠更有效地促進Ganodermasp. X1對木質素的降解，并提升粗蛋白含量，同時縮短了發酵時間。

以上研究表明Ganodermasp. X1固態發酵白酒糟能有效地提高酒糟的品質，一方面有效降解酒糟中木質素并保存纖維素；另一方面可有效提高粗蛋白的含量，有效保存營養，因此在降解酒糟木質素制備高品質粗飼料方面具有潛在的應用價值。