急性鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)暴露對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)幼魚炎性反應相關基因表達的影響

張木子， 袁莉霞， 黎 明， 王日昕

(寧波大學 海洋學院， 寧波 315211)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，雜食偏肉食性，在我國南方是一種非常重要的名優(yōu)經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，其肌肉中富含人體所需的多種必需氨基酸，尤其是沒有肌間刺的優(yōu)點，深受廣大老百姓的喜愛。隨著市場需求量的不斷上漲，據(jù)《2017中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[11]發(fā)布的權威數(shù)據(jù)顯示，截至2016年底，全國黃顙魚產(chǎn)量達到42萬t，業(yè)已成為我國重要淡水養(yǎng)殖種類之一。本實驗室前期研究表明，DEHP暴露能夠影響黃顙魚生長、抗氧化、免疫力及抗病力，基于這個發(fā)現(xiàn)，本研究旨在評估急性DEHP暴露對黃顙魚炎性反應相關基因(TNF、IFN和IL8)表達的影響，試圖查明炎性反應與DEHP中毒之間可能的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖管理及取樣

黃顙魚幼魚購自浙江嘉興，毒性實驗在寧波大學校內基地進行。暫養(yǎng)30 d后，挑選270尾體格健壯、大小均勻的魚苗(1.80±0.20)g，隨機分配到9個300 L塑料養(yǎng)殖桶中(每個處理設置3個重復)，每桶30尾。基于自然水體中DEHP最低濃度0.1 mg/L，以及約9.5 mg/L DEHP半致死濃度[2，10]，實驗設置3個DEHP處理組，分別為對照組(0 mg/L DEHP)、中濃度組(0.1 mg/L DEHP)和高濃度組(1 mg/L DEHP)，脅迫周期為96 h，期間停止投喂飼料。DEHP(Bellefonte, 美國)原液在0.1 mg/L tween 80助溶劑中溶解后，進一步稀釋到期望濃度。DEHP濃度的測定采用高效液相色譜法(HPLC)[12]。整個實驗過程中，水溫26 ℃～28 ℃，溶氧(7.81±0.13)mg/L，亞硝酸鹽<0.5 mg/L，保持自然光照。

實驗開始后，分別于0、12、24、48和96 h取樣，每次每桶隨機挑選3尾實驗魚，MS-222麻醉后解剖獲取肝臟，液氮速凍，-80 ℃保存，備用。

1.2 基因mRNA表達量分析

黃顙魚肝臟的總RNA的提取采用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，大連)，利用Prime ScriptTMPT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)反轉錄成cDNA用于實時熒光定量PCR分析。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)。實時熒光定量PCR(SYBR Premix ExTaqII，TaKaRa，大連)，擴增程序為95 ℃預變性5 min；40個循環(huán)包括95 ℃變性 20 s，57 ℃退火 25 s，72 ℃延伸 25 s。采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達量[13]。

表1 黃顙魚炎性反應相關基因和內參基因RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 DEHP不同暴露時間對TNF基因表達的影響

在96 h暴露過程中，對照組實驗魚肝臟中TNF基因表達量無顯著性變化(P>0.05)，見圖1；中、高濃度組實驗魚肝臟中TNF基因表達量呈先升高后降低趨勢，表達量最高值分別出現(xiàn)在24和12 h(P<0.05)；DEHP暴露達12 h時，高濃度組實驗魚肝臟中TNF基因表達量顯著最高，其次是中濃度組，而對照組TNF基因表達量最低(P<0.05)；暴露時間分別達24、48和96 h時，中濃度組實驗魚肝臟中TNF基因表達量顯著高于高濃度組(P<0.05)。

2.2 DEHP不同暴露時間對INF基因表達的影響

在96 h暴露過程中，對照組實驗魚肝臟中IFN基因表達量無顯著性變化(P>0.05)，見圖2；中濃度組實驗魚肝臟中IFN基因表達量呈先升高后降低趨勢，而高濃度組則呈逐漸降低趨勢(P<0.05)；暴露時間分別達12、24、48和96 h時，中濃度組實驗魚肝臟中IFN基因表達量均顯著最高，其次是對照組，而高濃度組IFN基因表達量顯著最低(P<0.05)。

不同大寫字母(A、B、C)表示DEHP暴露濃度的影響存在差異性顯著; 不同小寫字母(a、b、c)表示DEHP暴露時間的影響存在差異性顯著(P<0.05)。下同

圖1 DEHP對黃顙魚肝臟TNF基因表達的影響

Figure 1 The effect of DEHP onTNFgene expression in liver of yellow catfish

圖2 DEHP對黃顙魚肝臟IFN基因表達的影響

2.3 DEHP不同暴露時間對IL8基因表達的影響

在96 h暴露過程中，對照組實驗魚肝臟中IL8基因表達量無顯著性變化(P>0.05)，見圖3；中、高濃度組實驗魚肝臟中IL8基因表達量呈先升高后降低趨勢(P<0.05)；DEHP暴露達12 h時，中濃度組實驗魚肝臟中IL8基因表達顯著最高，其次是高濃度組，而對照組IL8基因表達最低(P<0.05)；暴露時間分別達24、48和96 h時，對照組實驗魚肝臟中IL8基因表達量顯著最高，而中濃度組實驗魚肝臟中IL8基因表達量顯著高于高濃度組(P<0.05)。

3 討論

在哺乳類，經(jīng)大量研究證實，鄰苯二甲酸酯類化合物(如DEHP)能夠激活炎性細胞中的細胞因子和炎性相關因子，加劇炎性反應進程，繼而對機體的免疫系統(tǒng)造成損傷[6]。王佳等[14]在人單核細胞白血病細胞株THP-1的研究中發(fā)現(xiàn)，1 μmol/LDEHP是通過誘導MMP-8、IL-1β等基因和蛋白的表達，誘導細胞內產(chǎn)生氧自由基(ROS)，從而激發(fā)炎癥反應。Oh等[15]報道，100 μmol/L DEHP能使人HMC-1細胞系中炎癥性介質IL-1β和COX-2的表達量顯著增加。但在低等動物(包括魚類)中，DEHP暴露誘發(fā)炎癥反應及免疫損傷的研究僅見零星的報道。Lee等[16]報道，1 μmol/LDEHP暴露能夠顯著上調搖蚊(Chironomustentans)熱休克蛋白(HSP)基因和蛋白的表達量；Lu等[2]發(fā)現(xiàn)，0.2 μg/LDEHP暴露上調了菲律賓蛤仔免疫相關基因(如CypA-1和HSP90)的表達；Huang等[17]研究表明，青鳉魚(Oryziasmelastigma)暴露到1 mg/LDEHP中，肝臟中IL1β基因的表達量顯著上調。腫瘤壞死因子是一類多功能的細胞內信號接頭分子，由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，在細胞內能夠與下游信號分子相互作用，誘導炎癥反應，在增強機體免疫應答反應中發(fā)揮重要作用，但過多的腫瘤壞死因子會造成組織損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，中濃度的DEHP激活了實驗魚肝臟中TNF的表達，但持續(xù)暴露達24 h后，TNF的表達量達到飽和。相比而言，高濃度DEHP暴露能夠在12 h內迅速升高TNF的表達量，這種現(xiàn)象可能是由于高濃度的DEHP在短期內引起“毒性興奮效應”[19]造成的，但隨著暴露時間的延長，其表達量逐漸降低到對照組之下。本研究提示，黃顙魚肝臟中TNF基因的表達與DEHP之間存在明顯的劑量依賴效應，低濃度的DEHP能夠激活肝臟中TNF基因的表達，但DEHP暴露濃度超過生理耐受閾值時，其mRNA的表達量將受到顯著抑制。

圖3 DEHP對黃顙魚肝臟IL 8基因表達的影響

干擾素在機體應答環(huán)境脅迫(如病毒感染)的過程中發(fā)揮重要作用。在哺乳類研究中已證實，IFN是典型的Th1分泌細胞因子，通過激活IL12刺激先天免疫和適應性免疫系統(tǒng)對外源異物進行清除[20]。黃貝等[21]報道，受到異源性抗原物質刺激后，斑點叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)、虹鱒和石斑魚(Epinepheluscoioides)血細胞中IFN基因的mRNA表達水平顯著提高。與上述報道相同，本研究發(fā)現(xiàn)，中濃度DEHP暴露顯著上調了黃顙魚肝臟中IFN基因的mRNA表達量。然而，高濃度的DEHP暴露卻抑制了實驗魚肝臟中IFN的表達，INF的表達量在96 h毒性脅迫過程中持續(xù)下降。結果提示，低濃度DEHP暴露通過上調IFN的表達參與機體免疫應答，但高濃度DEHP暴露則會對正常的生理活動造成抑制。

在本研究中，與TNF和IFN基因的表達情況相比，實驗魚肝臟中IL8基因的表達更易受到DEHP毒性的影響。DEHP暴露達12 h時，中、高濃度組實驗魚肝臟中IL8基因的表達量均顯著高于對照組，這種現(xiàn)象可能是一種機體自身的生理保護策略，以避免過度誘發(fā)細胞凋亡。龐雪利等[22]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)基中IL 8含量的升高，能夠激活細胞中PI3K/AKT信號通路，從而上調Bcl-2、下調caspase-3基因mRNA的表達量，達到抑制細胞凋亡的目的，并通過Western Blot做出進一步的驗證。Ghosh等[23]提出，短期高濃度DEHP暴露能夠減少NF-κB信號通路的活化，減少由于細胞凋亡過度激活對機體造成的傷害。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著DEHP暴露時間的延長，中、高濃度組實驗魚肝臟中IL8基因的表達量均顯著下降，且低于對照組。結果提示，魚類能夠通過調控細胞凋亡和炎癥反應，在短期內阻止DEHP對免疫系統(tǒng)造成的傷害，但這種防御機制受到生理耐受閾值的限制。

4 結論

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚肝臟中炎性反應相關基因的表達與DEHP之間存在明顯的劑量依賴效應，低濃度的DEHP能夠激活炎性反應相關基因的表達，而高濃度的DEHP暴露將抑制炎性反應相關基因的表達。