Kisspeptin和N-氨甲酰谷氨酸對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

馮 濤, 韋尚麗, 許曉玲, 白佳樺, 肖銀霞, 鄭 琛, 田見暉, 劉 彥

(1. 北京市農林科學院 畜牧獸醫研究所, 北京 100097; 2. 甘肅農業大學 動物科學技術學院, 蘭州 730070; 3. 中國農業大學 動物科學技術學院, 北京 100193)

下丘腦產生和分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是啟動和調控繁殖機能的關鍵步驟[1]。下丘腦GnRH神經元作為哺乳動物中樞生殖調控體系的最終共同通路，GnRH的合成和分泌受到諸多因子的直接和間接調控以及神經元之間相互作用的調控[2]。雖如此，但GnRH神經元在人和哺乳動物的腦內數量很少，且彌散地分布于前腦的嗅區、隔區及下丘腦等區域，要想在體內精確對GnRH神經元及其相關功能開展研究難度很大；同時通過原代培養的方法直接研究下丘腦GnRH神經元的功能也存在很大困難[3]。目前，相當多的研究是利用下丘腦永生的GnRH神經元細胞系GT1-7細胞作為工具開展相關研究工作[4]。GT1-7細胞在表型形態、超微結構、基因表達、激素儲存以及分泌的方式均與GnRH神經元完全一樣，且能在體外分裂傳代，是體外研究GnRH神經元的理想細胞模型[5-7]。

哺乳動物在初情期前，KiSS-1和GPR54基因表達水平會升高[8-9]，而中樞注射kisspeptin(KiSS-1基因編碼的肽)能增加初情期前和成年哺乳動物GnRH釋放[10-11]；此外，人和小鼠GPR54(kisspeptin的受體)突變會導致出現不育等表型的性腺機能衰退癥[12-13]。因此，KISS/GPR54系統被認為是青春期啟動的開關[3]。前期有研究表明kisspeptin-10刺激GT1-7細胞可促進GnRH分泌[14]。我們的研究表明，體外N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylgulamate，NCG)處理GT1-7細胞12 h呈劑量依賴性抑制GnRH分泌，其原因之一是下調了GT1-7細胞KiSS-1基因的表達[2]；但體內在后備母豬日糧中添加NCG可提升血液中雌激素水平，促進性器官和卵泡發育，促進初情期發育[2]。而kisspeptin和NCG組合添加對于GT1-7細胞GnRH分泌會產生什么樣的影響目前尚不清楚。本研究利用GT1-7細胞，體外模擬初情期前的生理環境，研究kisspeptin和NCG對GT1-7細胞增殖和GnRH分泌的影響，進一步闡明NCG促進性發育可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

本試驗所用GT1-7細胞系為美國加州大學Mellon教授惠贈。主要實驗儀器有：CO2恒溫培養箱、酶標儀(Thermo公司)、生物安全柜(Heal Force公司)、臺式高速冷凍離心機、紫外分光光度計(Eppendorf公司)、倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)等。

1.2 試劑與耗材

DMEM高糖培養液、胎牛血清、青鏈霉素混合液、Try-EDTA(Gbico公司)、kisspeptin-10(AnaSpec公司)、NCG(Sigma公司)、小鼠GnRH酶聯免疫檢測試劑盒(TSZ公司)。

1.3 GT1-7細胞培養

將GT1-7細胞從液氮取出后，37 ℃水浴復蘇于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養液中，然后900 r/min離心4 min，在超凈工作臺中使用新鮮的完全培養液重懸后接種于培養瓶，培養于恒溫37 ℃、飽和濕度、5% CO2的無菌培養箱中，每隔24 h更換新的培養液。待GT1-7細胞鋪滿至培養瓶底面的80%～90%時，使用0.25%的胰酶(Try-EDTA)消化，待細胞開始從培養瓶壁上掉落時使用含有血清的完全培養液終止消化并多次吹打，將細胞懸液轉移至無菌Ep管后900 r/min離心4 min棄上清，重懸后接入新的培養瓶進行傳代。培養至3代以上細胞狀態穩定時[2, 15]。

1.4 Kisspeptin-10和NCG處理GT1-7細胞

待傳代后的GT1-7細胞在培養瓶底面匯合至80%～90%時可消化重懸后用于試驗。將得到的GT1-7細胞懸液使用細胞計數儀測其密度，根據濃度稀釋至5×105個/mL的濃度均勻接種至12孔板中，每孔2 mL，每個處理3個重復，培養于二氧化碳恒溫培養箱。待細胞匯合至80%～90%時，取出至無菌工作臺，輕輕吸去培養液，各孔用1 mL PBS洗滌2遍，以去除血清對試驗的干擾，然后每孔接入2 mL無血清DMEM配制的不同濃度kisspeptin-10和/或NCG進行處理，重新置于二氧化碳培養箱并計時[2, 15]。

首先進行不同濃度kisspetin-10單獨處理GT1-7細胞的研究，kisspeptin-10的終濃度分別為10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L[14]，處理時間為12 h。在此基礎上選擇顯著促進GT1-7細胞增殖的kisspeptin-10濃度(100 pmol/L)開展共培養實驗。共培養實驗中NCG的濃度分別為 10 μmol/L、100 μmol/L和1 mmol/L[2]，處理時間為12 h。

1.5 GT1-7細胞計數

處理結束后將細胞培養板從培養箱中取出，吸取細胞培養液并收集細胞。培養液用無菌Ep管收集，2000 r/min離心20 min，取上清液測定GnRH濃度。細胞沉淀的收集使用胰蛋白酶處理法，吸除多余培養液，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌細胞2次，然后向孔中緩慢加入200 μL 0.25%胰酶消化至脫離容器壁時，使用含有血清的完全培養液300 μL終止消化，吹打混勻后將細胞懸液轉移至RNase-Free Ep管中，再用500 μL的DMEM沖洗細胞培養孔后將液體轉移至Ep管中，充分重懸后吸取10 μL利用細胞計數儀進行細胞計數[2]。

1.6 GnRH濃度測定

實驗使用美國TSZ公司生產的小鼠GnRH酶聯免疫標記檢測試劑盒檢測GT1-7細胞GnRH的分泌。使用已知濃度的標準品制作GnRH標準曲線，然后利用酶標儀根據樣品在420 nm處的吸光值，計算樣品GnRH濃度。具體操作按照試劑盒使用說明進行，本研究中GnRH標準曲線的R2為0.9996，測定批次間和批次內的變異系數分別是8.5%和9.9%。

1.7 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 Kisspeptin-10對GT1-7細胞增殖和GnRH分泌的影響

體外用kisspeptin-10處理GT1-7細胞，細胞增殖呈劑量依賴性變化(圖1)。當kisspeptin-10濃度為10～100 pmol/L時，對細胞增殖呈劑量依賴性促進作用(P<0.05)，而當kisspeptin-10濃度為100 pmol/L～10 nmol/L時，隨處理濃度增加對細胞增殖的促進作用減弱(P<0.05)。與對照組相比，100 pmol/L和1 nmol/L的kisspeptin-10處理12 h后細胞數可分別增加92%和34%(P<0.05)。

相同小寫字母表示無顯著差異(P>0.05)；不同小寫字母表示存在顯著差異(P<0.05)；下同

圖1不同濃度kisspeptin-10對GT1-7細胞增殖的影響

Figure 1 Effects of different levels of kisspeptin-10 on GT1-7 cell proliferation

Kisspeptin-10體外對GT1-7細胞GnRH的分泌活性會產生影響。如圖2所示，kisspeptin-10對GnRH分泌呈現劑量依賴性作用，也呈現出先促進后抑制的作用(P<0.05)。與對照組相比，10 pmol/L、100 pmol/L和1 nmol/L的kisspeptin-10處理12 h后GnRH濃度分別增加了2.3、3.3和2.1倍(P<0.05)。

圖2 不同濃度kisspeptin-10對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

2.2 Kisspeptin-10和NCG對GT1-7細胞增殖和GnRH分泌的影響

如圖3所示，100 pmol/L的kisspeptin-10和1 mmol/L的NCG單獨添加均可促進GT1-7細胞增殖(P<0.05)；固定kisspeptin-10處理濃度為100 pmol/L，復合添加10 μmol/L和100 μmol/L的NCG培養12 h后，GT1-7細胞數與單獨添加kisspeptin-10或NCG相比顯著增加(P<0.05)，而1 mmol/L的NCG與kisspetin-10復合添加與二者單獨添加相比細胞數則無顯著變化(P>0.05)。

K: Kisspeptin-10; N: NCG

圖3 Kisspeptin-10和NCG對GT1-7細胞增殖的影響

Figure 3 Effects of kisspeptin-10 and/or NCG on GT1-7 cell proliferation

100 pmol/L的kisspeptin-10和1 mmol/L的NCG單獨添加對GT1-7細胞GnRH的分泌活性產生了不同的影響，kisspeptin-10可促進GnRH分泌(P<0.05)，而NCG則抑制了GnRH的分泌(P<0.05)，見圖4。固定kisspeptin-10處理濃度為100 pmol/L，復合添加NCG共培養12 h后，GT1-7細胞的GnRH分泌水平隨NCG添加濃度升高呈現劑量依賴性變化。如圖4所示，與kisspeptin-10單獨處理相比，100 μmol/L的NCG和kisspeptin-10共同處理對GnRH分泌水平無顯著影響(P>0.05)，而1 mmol/L的NCG和kisspeptin-10共同處理可提高GnRH分泌水平57%(P<0.05)；與NCG單獨處理相比，NCG和kisspeptin-10共同處理可顯著提高GnRH分泌水平4.9～9.8倍(P<0.05)。

K: kisspeptin-10; N: NCG

圖4Kisspeptin-10和NCG對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

Figure 4 Effect of kisspeptin-10 and/or NCG on GnRH secretion in GT1-7 cells

3 討論

本實驗研究了kisspeptin-10和NCG單獨及組合處理對GT1-7細胞增殖以及GnRH分泌的影響，利用體外GnRH神經元細胞GT1-7模擬了性發育過程中kisspeptin-10和體外添加NCG對GnRH分泌的影響，對解析性發育過程中體外營養因子與體內生理環境的互作對GnRH的調控作用提供了參考。

下丘腦GnRH神經元是動物發情周期啟動的關鍵部位，GnRH神經元細胞受到多種因子的調控。已有研究表明多種營養因子可調控GnRH神經元的活性，如kisspeptin[17-18]、谷氨酰胺[19-20]、神經激肽B[1, 21]、NCG[2]、精氨酸[2]等，其中kisspeptin和NCG在體內均可以促進動物的性發育[2, 11]，這種促進作用主要是通過調控GnRH的分泌實現的。

體外培養并測定細胞數量變化是評價營養因子影響細胞生長的最佳方法[22]。利用體外培養的方法，我們發現kisspeptin和NCG均可以顯著促進GT1-7細胞的增殖，這與Novaira等[14, 18]和 Liu等[2]的研究結果一致，也充分說明了GT1-7細胞模型可以用于體外評價營養因子對GnRH的調控作用。本研究中也發現了kisspeptin可呈劑量依賴性促進GT1-7細胞增殖，濃度在100 pmol/L時刺激效果最明顯，隨著kisspeptin濃度增加，對GT1-7細胞增殖呈現劑量依賴性抑制作用，繼而影響GnRH的分泌，類似的現象在NCG體外處理牛卵巢顆粒細胞中也有報道[23]，可能的原因是隨著處理濃度的增加添加物對細胞的毒性進一步增強；而Novaira等[14, 18]在研究中均選用了1 nmol/L的劑量，這種處理劑量的差異可能與體外處理的時間有關，文獻中的最長處理時間為6 h，而本研究的處理時間為12 h，可見高濃度短時間處理和低濃度長時間處理均有促進GT1-7細胞增殖的作用。本研究選擇NCG的濃度為10 μmol/L、100 μmol/L和1 mmol/L，其原因主要是體外培養GT1-7細胞12 h，以上濃度的NCG可呈劑量依賴性促進GT1-7細胞增殖，其中以1 mmol/L刺激效果最為顯著[2]。體外用kisspeptin和NCG共同處理GT1-7細胞屬首次報道，與kisspeptin和NCG單獨添加相比，共同添加可顯著促進GT1-7細胞增殖，這也說明了在體外kisspeptin和NCG在促進GT1-7細胞增殖方面具有協同作用，可能的分子機制是kisspeptin的添加緩解了NCG處理對KiSS-1基因表達的抑制作用，也有可能是激活了細胞增殖相關的信號通路，這還有待進一步深入研究。

動物初情期啟動的主要原因是GnRH分泌增強，繼而觸發下游促性腺激素FSH和LH的釋放，引起卵巢和繁殖器官等發生一系列有助于排卵和適應妊娠的變化[14]。Kisspeptin可以引發初情期的主要原因是促進了GnRH的分泌[11]，這一機理在本研究的體外實驗中也得到驗證，即無論是kisspeptin-10處理6 h或12 h，均可以顯著促進GT1-7細胞GnRH的分泌。在后備母豬日糧中添加NCG可促進性發育，并提前初情期的時間[2]，體外GT1-7細胞培養研究發現1 mmol/L的NCG處理12 h在顯著促進細胞增殖的同時卻抑制了GnRH的分泌[2]，原因可能是NCG抑制了GT1-7細胞GnRH、nNOS、KiSS-1等基因的表達[2]。本研究在原來的工作基礎上[2]，體外為NCG促進性發育的機理提供了更多的證據，即NCG單獨處理GT1-7細胞可促進細胞增殖卻抑制GnRH分泌，kisspeptin-10單獨處理可同時促進GT1-7細胞增殖和GnRH分泌，二者共同作用對GT1-7細胞增殖有協同刺激效應，但更重要的是對GnRH分泌的促進作用，可能是因為kisspeptin-10緩解了NCG處理對KiSS-1等初情期相關基因表達的抑制作用，并隨著NCG濃度的增加對GnRH分泌呈劑量依賴性促進作用。這進一步說明了NCG在體內外可通過kisspeptin或與kisspeptin相互作用對性發育發揮積極的調控作用。

4 結論

利用GT1-7細胞體外研究表明，kisspeptin-10和NCG能協同促進GT1-7細胞增殖，NCG單獨處理GT1-7細胞抑制GnRH分泌，但在一定濃度kisspeptin-10存在的條件下，NCG能夠呈劑量依賴性促進GnRH的分泌。