黃鱔白細胞介素1β基因在大腸桿菌中的重組表達及活性分析

楊 龍， 臧彧偉， 鄭淑婷， 李 偉

(長江大學 生命科學學院， 荊州 434025)

白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)是細胞因子IL-1家族的重要成員。IL-1β不僅可以促進炎癥發生，而且在調節細胞代謝、造血及調控其他細胞因子表達等多種生理過程中起重要作用[1-2]。當受到有絲分裂原、細胞因子和微生物產物等相關因子刺激時，IL-1β分子通過與細胞表面的受體結合激活細胞的免疫調節與炎癥反應[3]。機體內IL-1β分子的活性很大程度上受到白細胞介素1受體水平的影響[4]。與哺乳動物等高等脊椎動物不同的是，作為低等脊椎動物，魚類獲得性免疫系統不夠發達，更多依賴天然免疫系統中的免疫分子對抗外界病原的侵染[5]。國內外有關于魚類IL-1β分子在魚類天然免疫系統中作用的研究由來已久，并取得了非常大的進展[6]。通過基因克隆、組織表達譜分析及重組表達IL-1β分子活性鑒定等研究，魚類IL-1β分子的功能及表達調控逐漸清晰[7-12]。黃鱔作為我國及東南亞地區廣泛養殖的淡水魚類，其健康養殖受到了多種細菌性病害的制約，開展其天然免疫分子功能的研究對黃鱔養殖業的健康發展具有重要作用。Xu等通過同源克隆的方法得到了黃鱔IL-1β基因序列并闡明了其基因結構；分析了病原類似物對其表達水平的影響，但對其生物學活性及功能并未開展研究[7]。研究指出，醛酮還原酶(AKR)是活性氧產生及炎癥反應中的重要指標分子[13]，其表達水平與Nrf2信號通路及NF-κB-IL-1β信號通路間具有密切關系[14]。因此，筆者擬通過基因特異性引物擴增黃鱔IL-1β基因，構建其重組表達載體，實現蛋白的分離及純化。通過熒光定量PCR技術分析腹腔注射黃鱔rIL-1β重組蛋白對肝臟IL-1β、NF-κB、AKR和Nrf2等基因表達的影響，為深入了解黃鱔IL-1β基因在NF-κB-Nrf2信號通路中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

原核表達載體pET28a 購自Novagen公司；大腸桿菌感受態DH5α、BL21(DE3)、pEASY-T1克隆載體等購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶、T4DNA 連接酶等購自NEB公司；質粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、DNA聚合酶等購自北京全式金公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自Invitrogen 公司；Ni-NTA純化柱購自上海七海復泰生物科技有限公司；DAB 顯色試劑盒、硝酸纖維素膜購自武漢谷歌生物公司；熒光定量用總RNA柱提試劑盒、反轉錄試劑盒和SYBR Mix均購于南京諾唯贊生物科技有限公司。6His標簽的鼠源單抗和HRP標記的羊抗鼠IgG購買于Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 黃鱔IL-1β基因原核表達載體的構建

根據GenBank數據庫黃鱔IL-1β基因的序列(KM113036)設計一對基因特異性引物IL-F和IL-R(表1)，以黃鱔肝臟cDNA為模板進行PCR擴增。擴增得到的產物進行純化后克隆至pEASY-T1載體，轉化大腸桿菌DH5α，選取陽性菌落進行序列測定。

測序所得序列在NCBI數據庫進行Blastn和Blastp分析，以確定序列同源性。采用在線軟件： http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/進行信號肽分析，使用在線軟件https://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/PSScan.cgi進行蛋白質二級結構預測。然后根據表達載體pET28a的多克隆位點和測序所得IL-1β基因序列設計一對特異性表達引物rc-F和rc-R(表1)，以pEASY-IL-1β質粒為模板，進行PCR擴增。上、下游引物分別添加了BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后并用膠回收試劑盒回收純化后與同樣雙酶切的pET28a進行連接反應。連接產物轉化DH5α感受態細胞，重組子經菌液PCR及雙酶切驗證后進行測序驗證。

表1 本研究所使用的引物序列及用途

注：下劃線表示酶切位點；F:上游引物，R：下游引物

1.2.2 重組蛋白的誘導表達及純化

測序驗證的質粒轉化BL21(DE3)后，于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上過夜培養。挑單菌落接種于5 mL含卡那霉素的液體LB培養基中，于37 ℃ 200 r/min振蕩培養過夜。菌液按1∶1000轉接于200 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的液體LB培養基，37 ℃ 200 r/min振蕩培養至OD600值約0.6時，加入終濃度為1 mmol/mL 的IPTG，繼續振蕩培養4 h。于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min收集菌體，加入5 mL PBS緩沖液，冰浴進行超聲波破碎。離心收集上清液，沉淀加入適量PBS 緩沖液(pH 8.0，50 mmol/L，含8 mol/L尿素)重懸，于4 ℃中靜置1 h 以上去除包涵體，再次離心，合并收集的上清液。經0.45 μm濾膜過濾后加入鎳離子親和層析柱中結合2 h，用梯度咪唑濃度(20、100、200和300 mmol/L) 的PBS 緩沖液進行洗脫。洗脫液收集裝入透析袋中于4 ℃透析過夜，取適量蛋白進行12%的SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.3 重組蛋白的Western Blot分析

將經IPTG誘導的含空質粒菌株和重組菌的菌液、純化后的重組蛋白各取100 μL進行SDS-PAGE電泳。隨后將蛋白轉移到NC膜上，用TBST緩沖液(含5%脫脂牛奶)4 ℃封閉過夜；加入1∶10 000稀釋的His標簽的一抗后在37 ℃搖床上孵育2 h；加入用Hrp標記的羊抗鼠二抗(1∶15 000)，37 ℃ 孵育1 h；每次反應后用TBST洗5次，每次5 min，最后用DAB(二氨基聯苯胺)顯色劑顯色并拍照。

1.2.4 腹腔注射重組蛋白對肝臟相關基因表達的影響

首先，將純化得到的rIL-1β蛋白用BCA蛋白質定量試劑盒進行定量。然后，將40尾生長一致的健康黃鱔(體質量50 g±3 g)隨機分為兩組。一組腹腔注射1 mL 1×PBS作為陰性對照；另一組黃鱔按2.0 μg/kg劑量注射rIL-1β蛋白。分別在首次注射0、3、6、9、12和24 h后從PBS組和IL-1β組中隨機取3尾魚，取其肝臟組織加入500 μL Trizol試劑保存于-80 ℃以備RNA提取，以上生物學實驗重復3次。

按照總RNA 提取試劑盒說明書提取黃鱔肝臟總RNA，速凍后置于-80 ℃冰箱中保存備用。按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA 反轉錄為cDNA，置于-20 ℃中保存備用。

采用熒光定量PCR的方法分析腹腔注射重組蛋白rIL-1β對肝臟IL-1β、NF-κB、AKR和Nrf2等基因表達的影響。設計的熒光定量的引物分別為rt-IL-F和rt-IL-R，rt-NF-F和rt-NF-R，rt-AK-F和rt-AK-R，rt-E2-F和rt-E2-R(表1)。以不添加模板的反應作為空白對照，以β-actin的表達作為內參。熒光定量PCR在CFX96 RT-PCR系統(Bio-RAD)上進行。20 μL反應體系中包含1 μL模板，10 μL SYBR qPCR master mix，0.4 μL上下游引物，8.2 μL ddH2O。PCR反應條件為95 ℃預變性1 min；95 ℃變性5 s，57 ℃退火30 s，共40個循環。

每個處理重復3次，數據處理采用SPSS20.0軟件包中的單因素方差分析進行。基因表達值用平均值±標準差表示，并進行多重比較檢驗。當P<0.05時為差異顯著，當P<0.01時差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黃鱔IL-1β基因的獲得及序列分析

利用基因特異性引物對IL-F/R，從黃鱔肝臟cDNA中擴增得到一條長741 bp的條帶，經過克隆測序后分析得知：所得序列推斷的多肽鏈與KM113036序列推斷的多肽鏈間具有95%的同源性；該基因編碼的多肽鏈沒有典型的信號肽序列，也沒有ICE信號切割位點；但具有IL-1家族的典型信號特征和1個N糖基化位點，屬于IL-1β基因家族成員(圖1)；該基因在申請GenBank中登錄的序列號為KY886912。

陰影表示N-糖基化位點；方框表示IL-1家族信號

圖1黃鱔IL-1β基因的核苷酸序列及推斷的氨基酸序列

Figure 1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of swamp eel IL-1β

2.2 原核表達載體的構建、表達純化及鑒定

利用基因特異性引物對rc-IL-F/R從pEASY-IL-1β質粒上獲得含有酶切位點的片段后與pET28a載體分別進行雙酶切，回收目的片段連接、轉化DH5α感受態細胞。將重組子提取質粒進行菌液PCR和雙酶切鑒定。結果表明：陽性重組子擴增得到和目的基因一致大小的片段，并且用BamH I和XhoI對重組質粒進行的雙酶切表明，IL-1β基因已經正確插入到pET28a載體中(圖2)。測序結果證實，已成功構建黃鱔IL-1β基因表達載體。

1：IL-1β基因的菌液PCR擴增；2：重組質粒的雙酶切；M：DNA分子量標準

圖2黃鱔IL-1β基因重組質粒的菌液PCR與雙酶切檢測

Figure 2 PCR and double-enzyme digestion detection of recombinant vector

通過Ni-NTA親和層析柱用不同咪唑濃度的PBS緩沖溶液進行洗脫，純化得到了重組蛋白rIL-1β。12%的 SDS-PAGE電泳檢測顯示純化的rIL-1β無雜蛋白，分子量約為33 ku，符合預期大小(圖3-A)。

將SDS-PAGE凝膠中蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，分別用小鼠抗6His-tag單克隆抗體為一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠二抗進行Western Blot免疫印跡顯示，帶有6His標簽的融合蛋白被特異性識別，含空質粒的菌株及含重組質粒未誘導的菌株均沒有相應條帶(圖3-B)。SDS-PAGE及Western Blot分析表明已實現了rIL-1β蛋白的誘導表達及純化。

A：重組蛋白的SDS-PAGE電泳；B：Western Blot檢測重組蛋白。1：含空載體的菌株誘導后；2：未誘導的重組菌；3：重組菌IPTG誘導后；4：純化后的rIL-1β蛋白；M：蛋白質分子量標準

圖3重組蛋白rIL-1β的表達與檢測

Figure 3 Expression and detection of the recombinant protein rIL-1β

2.3 腹腔注射rIL-1β對肝臟IL-1β和NF-κB基因表達的影響

腹腔注射重組rIL-1β蛋白后，在不同時間點取肝臟組織的總RNA反轉錄獲得cDNA，采用熒光定量PCR分析了IL-1β和NF-κB基因的轉錄水平。結果表明：腹腔注射rIL-1β蛋白后，各時間點黃鱔肝臟IL-1β基因表達水平都有不同程度增加；除注射后3 h，其余各時間點處理組肝臟IL-1β基因表達水平均顯著高于對照組(P<0.05),結果見圖4-A。同時期肝臟NF-κB基因的表達水平也呈不同程度的增加；腹腔注射rIL-1β后3 h時，NF-κB基因的表達顯著高于對照組(P<0.05)，其余各時間點NF-κB基因的表達水平雖有增加，但未達到顯著性差異(圖4-B)。這說明外源性的重組rIL-1β蛋白對組織IL-1β和NF-κB基因的表達具有誘導作用。

2.4 腹腔注射rIL-1β對肝臟AKR和Nrf2基因表達的影響

同樣地，腹腔注射重組rIL-1β蛋白后，采用熒光定量PCR分析了肝臟AKR和Nrf2基因的轉錄水平。結果顯示：腹腔注射rIL-1β蛋白后，各時間點黃鱔肝臟AKR基因表達水平都有不同程度降低；除注射后3 h，其余各時間點處理組肝臟AKR基因表達水平均顯著低于對照組(P<0.05)，同時期肝臟Nrf2基因的表達水平也呈不同程度的減少；腹腔注射rIL-1β后12 h時Nrf2基因的表達顯著低于對照組(P<0.05)，其余各時間點NF-κB基因的表達水平呈不同程度的降低，但未達到顯著性差異(圖5-B)。這說明外源性的重組rIL-1β蛋白對肝臟AKR和Nrf2基因的表達具有抑制作用。

A:熒光定量PCR檢測IL-1β的表達; B:熒光定量PCR檢測NF-κB的表達

圖4腹腔注射重組蛋白rIL-1β對肝臟IL-1β和NF-κB基因表達的影響

Figure 4 Expression analysis ofIL-1βandNF-κBin liver after rIL-1β injection

3 討論

白細胞介素1β(IL-1β)是機體響應病原感染并激活炎癥反應過程中的重要細胞因子[2]。IL-1β分子不但可以啟動自身的表達而且還可以協調下游相關基因的表達，進而激活多種下游信號通路[15]。當機體受病原細菌、病毒及其類似物刺激時，IL-1β分子總是快速激活并以不同形式參與抗病毒、抗感染的免疫過程[16]。許多魚類的白細胞介素1β基因被克隆，其表達模式及在免疫系統中的作用被深入探究。黃鱔是我國及東南亞地區重要的淡水養殖品種，其可持續發展受到了細菌性病害如出血病的制約[17]。開展免疫相關基因克隆及其生物學功能研究有利于促進黃鱔的健康養殖和分子標記輔助育種工作。雖然黃鱔的IL-1β基因已有相關報道，其生物學活性及其在炎癥反應中的作用尚不清楚[7]。筆者根據已報道的黃鱔IL-1β基因設計特異性引物，從黃鱔肝臟中擴增獲得了黃鱔IL-1β基因的cDNA序列。序列分析發現所克隆的序列與已知序列推斷的多肽鏈之間存在5%的差異，因此作者認為所得序列為已知黃鱔IL-1β基因的一個等位基因。有研究指出，IL-1β基因具有豐富的多態性且與機體的抗、染病能力密切相關[18]。因此，將來有必要深入開展黃鱔IL-1β基因多態性與易感出血病之間關聯關系的研究。

A：熒光定量PCR檢測AKR基因的表達； B：熒光定量PCR檢測Nrf2基因的表達

圖5腹腔注射重組蛋白rIL-1β對肝臟AKR和Nrf2基因表達的影響

Figure 5 Expression analysis ofAKRandNrf2 in liver after rIL-1β injection

細菌重組表達的斑點石斑魚和赤魟魚的IL-1β蛋白都表現出了良好的生物學活性，通過腹腔注射或者免疫細胞都激活了內源性IL-1β基因的表達[8,19]。本實驗中，筆者獲得的重組黃鱔rIL-1β也呈現出類似的生物活性，可以激活肝臟IL-1β基因的表達。眾所周知，NF-κB是IL-1β的上游轉錄因子，IL-1β的表達受NF-κB活性的調控作用。筆者發現腹腔注射rIL-1β蛋白一定程度上誘導了肝臟NF-κB基因的表達。IL-1β基因上調的原因可能是rIL-1β蛋白部分激活了NF-κB基因的表達[20]。轉錄因子Nrf2是活性氧代謝中重要的調控因子，可以調控一系列抗炎、抗氧化等保護性基因的表達維持組織細胞正常生理活動[21]。其中，醛酮還原酶(AKR)就是Nrf2-ARE信號通路的重要靶標之一[22]。本實驗中，筆者發現腹腔注射rIL-1β蛋白顯著抑制了肝臟AKR基因的表達且一定程度上降低了Nrf2基因的表達水平。因此，AKR下調表達的原因是rIL-1β蛋白對其上游轉錄因子Nrf2產生了抑制作用[23]。IL-1β基因在Nrf2-NF-κB交叉信號通路中的具體作用有待深入研究。

4 結論

克隆了黃鱔白細胞介素IL-1β基因并實現了該基因的重組表達。通過Ni離子親和層析純化得到的rIL-1β蛋白有較好的生物學活性，體內研究表明rIL-1β蛋白能夠影響黃鱔肝臟IL-1β、NF-κB、AKR和Nrf2等免疫相關基因的表達。