異葉天南星凝集素基因的克隆及蛋白的結構性質分析

李 晟， 趙德蕊， 張聲祥， 施圓圓， 楊青山,4， 王晨凱， 單春苗， 吳家文

(1. 安徽中醫藥大學 藥學院, 合肥 230012； 2. 安徽中醫藥大學 研究生院, 合肥 230012；3. 安徽中醫藥大學科研實驗中心 新安醫學教育部重點實驗室, 合肥 230038；4. 安徽道地中藥材品質提升協同創新中心, 合肥 230012； 5. 安徽省中醫藥科學院, 合肥 230012)

異葉天南星(ArisaemaheterophyllumBlume)是一類重要的中草藥，它的塊莖在亞洲地區具有悠久的藥用歷史。其性溫，氣微辛，味辣，歸脾、肝、肺經，主要用于燥濕化痰、祛風定涼、消腫散結以及治療破傷風、跌打損傷和毒蛇咬傷等[1]，同時還具有消炎、止痛和抗腫瘤的功效，在臨床上與其他中草藥配伍可有效治療肺癌、食管癌等疾病[2]。張志林等[3]已用MTT法證實天南星水提取物和乙醇提取物對體外宮頸癌Hela細胞、白血病K562細胞、胃癌BGC823細胞均有抑制增殖作用，且在動物試驗中證實這些提取物對機體免疫系統沒有明顯影響。

凝集素(lectin)是一類在自然界中普遍存在的復雜非免疫球性蛋白或糖蛋白，現已從病毒、細菌、真菌、無脊椎動物、脊椎動物和植物中都分離出了凝集素[4-7]。凝集素在不同程度上參與了生物在正常和病理情況下的免疫過程。來源于植物或動物的凝集素作為一種潛在的治療藥物，由于其防御功能和誘導細胞凋亡的能力被廣泛用于治療癌癥[8-9]。目前，植物凝集素已在多種不同的植物物種中被檢測到，并顯示具有特異性識別并可逆結合糖類復合物的糖基部分的特性[10]。凝集素專一性結合不同的糖分子，據此可將凝集素分為甘露糖結合凝集素、半乳糖結合凝集素、葡萄糖結合凝集素、巖藻糖結合凝集素和唾液酸結合凝集素等幾類[11]。本研究所克隆的AhLTN凝集素屬于D-甘露糖結合凝集素，此類凝集素只特異性結合含D型甘露糖的凝集素受體。伴刀豆凝集素A屬于D-甘露糖凝集素類別，其表達蛋白伴刀豆球蛋白(ConA)具有自噬型細胞毒性和免疫調節雙重功能，可加速小鼠巨噬細胞培養物中細胞色素C的釋放和線粒體的聚集從而導致細胞凋亡，也能誘導黑色素瘤A375細胞凋亡[12-13]，在小鼠肝癌原位模型中，飼喂ConA后腫瘤組織發生了明顯的萎縮[14]。

自1982年Hoffman等[15]克隆出了第一個凝集素基因以來很多凝集素基因被成功克隆，例如凝集素基因已經先后從苦參[16]、石斛[17-18]等中藥材中被成功克隆。本研究通過對異葉天南星轉錄組數據分析得到Ahltn功能基因，通過RT-PCR等技術成功克隆出Ahltn的讀碼框序列片段，并進一步利用生物信息學軟件對其表達的蛋白質結構及性質進行了分析，以期為Ahltn基因和蛋白功能的進一步研究和開發利用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2018年3月于安徽中醫藥大學藥園采摘異葉天南星植株并被安徽中醫藥大學楊青山老師鑒定。用超純水將異葉天南星多次漂洗至潔凈后用濾紙擦拭吸干表面水分，隨即將根、莖和葉分開采集后放入離心管冷凍于液氮中，最后放入-80℃冰箱凍存保留以用于RNA的提取。

1.2 儀器與試劑

主要儀器與試劑列于表1和表2。

表1 主要儀器

表2 主要試劑

1.3 總RNA的提取以及cDNA的合成

從-80℃冰箱中取出異葉天南星樣品加入液氮中充分研磨成粉末，利用E.Z.N.A Plant RNA Kit試劑盒純化獲得異葉天南星葉的總RNA，具體步驟如下(離心速度均為12 000 r/min)： 1)500 μL RB漂洗緩沖液與10 μL β-巰基乙醇混合。2)將凍存的新鮮葉片放入研缽中，加液氮，充分研磨成細粉，分裝入1.5 mL EP管中；加入準備好的混合液，上下顛倒混合均勻，離心10 min。3)轉移上清約500 μL至DNA過濾柱中，離心2 min；加入1/2體積無水乙醇至流穿液中，上下顛倒5～10次。4)將液體轉移至純化柱中，離心10 min，棄濾液，將柱子放回收集管中；加入400 μL漂洗緩沖液，離心1 min，棄濾液和收集管。5)將純化柱放入2 mL新的收集管，加入漂洗緩沖液，離心1 min，棄濾液；重復本步驟一次。6)空管離心1 min，棄濾液和收集管；將純化柱轉移至新的1.5 mL EP管中，加30～50 μL焦碳酸二乙酯 (DEPC) 洗脫RNA，靜置10 min，離心2 min獲得總RNA。

進一步使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳驗證了RNA的濃度以及完整性，挑選優質的RNA為模板進行逆轉錄獲得cDNA。

1.4 引物設計

通過分析異葉天南星轉錄組測序的數據，獲得其中的一個凝集素功能基因(基因編號為CL2833)，通過軟件分析獲得其ORF序列(命名為Ahltn)，使用Primer 5.0軟件在其ORF兩端設計一對特異性擴增引物如下：Ahltn-S：5′-CATATGATGGCGGCAGCGAAGCCCGG-3′(26 bp)；Ahltn-A：5′-CTCGAGTCAGGCCCTGTTGCTCCCCGT-3′(27 bp)。

1.5 Ahltn基因的克隆

利用mRNA逆轉錄合成的cDNA為模板，采用兩步法對Ahltn基因進行擴增。RT-PCR反應體系為：2.5 μL 10×PCR緩沖液、16.0 μL 滅菌超純水、1.0 μL 10 mmol/L dNTP、1.0 μL 5 μmol/L上游及下游引物、2.0 μL cDNA、1.0 μL rTaqDNA聚合酶，共24.5 μL。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共10個循環；隨后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25個循環；最后72 ℃再延伸10 min。對RT-PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定以及膠回收試劑盒(AxyPrep)進行膠回收，從而得到純化的目的基因Ahltn。

表3 生物信息學軟件

1.6 構建克隆重組質粒pMD19-T-Ahltn

將Ahltn基因與pMD19-T載體連接，連接體系為1.0 μL T4 DNA 連接酶、1.5 μL pMD19-T載體、11.0 μLAhltn基因、1.5 μL 10倍濃度連接酶緩沖液共15.0 μL。隨后將其混勻置入16 ℃水浴鍋中連接12 h。采用42 ℃熱激法將連接產物轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，置于37 ℃恒溫培養箱中培養20 h左右至培養基中長出菌斑，然后挑取平板上陽性克隆個體置入液體培養液中擴大培養，再收集菌體提取重組質粒pMD19-T-Ahltn。最后選取PCR鑒定和雙酶切鑒定都正確的重組質粒進行測序鑒定(上海生工生物工程公司)。

1.7 生物信息學分析

利用在線軟件對Ahltn的堿基序列及其編碼蛋白的理化性質、同源性、進化關系、二級結構和三級結構進行了分析，具體見表3。

2 結果與分析

2.1 Ahltn基因克隆和鑒定

2.1.1 總RNA的提取

通過紫外分光光度計測得異葉天南星總RNA的OD260/OD280比值為2.0，經瓊脂糖凝膠電泳后發現在28 S、18 S和5 S處分別有3條清晰可見的亮帶(圖1-A)，說明總RNA的濃度、純度和完整性均符合實驗要求，可用于cDNA的合成。

2.1.2Ahltn基因的克隆

挑選高濃度的mRNA樣品為模板經逆轉錄得到cDNA。再以cDNA為模板，利用引物Ahltn-S和Ahltn-A進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后在500～750 bp處發現一條清晰的基因條帶(圖1-B)。

2.1.3Ahltn克隆載體的構建及鑒定

提純目的基因后將其連接到pMD19-T載體中，再將重組質粒轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，挑取陽性單克隆進行擴大培養，經菌液PCR鑒定后(圖1-C)出現明確的目的條帶；重組質粒經生工測序所得序列與異葉天南星轉錄組數據庫中CL2833基因序列一致，說明已成功克隆出Ahltn基因開放讀碼框，此序列已經提交到GenBank數據庫，登錄號為MH729820。

A：總RNA提取；B：Ahltn基因克隆；C：菌液PCR鑒定；箭頭表示目的基因條帶

圖1Ahltn基因的克隆與鑒定

Figure 1 Cloning and identification ofAhltn

2.2 生物信息學分析結果

2.2.1Ahltn序列分析

用SMS在線軟件將Ahltn的cDNA序列翻譯成氨基酸序列(圖2)，Ahltn基因的讀碼框長度為561 bp，編碼186個氨基酸的蛋白質，TGA為終止密碼子。

圖2 Ahltn的讀碼框序列和編碼的氨基酸序列

2.2.2Ahltn基因編碼蛋白的理化特性分析

Protparam 軟件分析顯示AhLTN蛋白質分子不穩定系數為22.39，低于閾值40，屬于穩定型蛋白；其等電點為9.14，為偏堿性蛋白；總平均親水性指數為0.17，為疏水性蛋白。其他理化性質列于表4。

2.2.3 AhLTN蛋白的基元分析

通過Motif Scan軟件分析，AhLTN含有多種基元，主要包含1個酰胺化位點、1個N-糖基化位點、4個酪蛋白激酶II磷酸化位點、5個蛋白激酶C磷酸化位點、5個N-蛋白質豆蔻酰化位點和1個C末端微體靶向序列(表5)，該蛋白屬于Bulb-lectin超家族。

表4 AhLTN的理化性質

表5 AhLTN蛋白的基元或結構域分析

2.2.4 AhLTN與不同物種凝集素蛋白的同源性比對及系統進化樹分析

通過NCBI BLAST軟件對不同物種之間的凝集素蛋白序列進行比對分析，結果表明AhLTN與其他植物的凝集素蛋白有較高的序列同源性。如表6所示，AhLTN與鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)、生姜(Zingiberofficinale)、郁金香雜交品種(Tulipahybridcultivar)和蔥蘭(Zephyranthescandida)等植物的凝集素蛋白序列同源性分別達到了70%、67%、64%和61%。在GenBank中獲取上述植物的凝集素蛋白序列后，由MEGA5.0軟件分析得到了AhLTN系統發育進化樹，結果如圖3所示。說明在現有的NCBI數據庫中AhLTN與鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)凝集素遺傳距離最短，親緣關系最近。這與其門綱關系相符合,即AhLTN與鐵皮石斛同屬于被子植物門單子葉植物綱。

2.2.5 AhLTN蛋白二級結構分析

利用MEGA 5.0、Clustalx 1.83和ESPript 2.2軟件把AhLTN與表5中的11種不同植物中凝集素蛋白進行了氨基酸序列比對(圖4)，并根據Swiss Model結構模型分析AhLTN蛋白S37-T136部分的二級結構(圖4，第一列)。結構顯示AhLTN蛋白S37-T136區域具有11個β折疊結構(S40-L42、Q45-Q49、Y52-Q57、C60-N66、V69-A73、V84-Q88、D92-F96、L103-S105、V117-Q121、N125-Y129、I133-A135)和9個TT結構(S37-G38、T43-G44、G50-N51、E58-D59、G67-R68、Y77-H88、R89-D90、G98-S99、P122-D123)。3個甘露糖結合保守序列QXDXNXVXY(在圖4中用綠色三角形標記)，分別位于Q57-Y65、Q86-F96、Q121-Y129，而Q86-F96序列中的D92和F96分別替換了保守序列中N和Y。

表6 AhLTN蛋白同源關系比對

圖3 AhLTN的系統進化樹

Figure 3 Phylogenetic tree of AhLTN

注：該進化樹是利用MEGA5.0軟件生成，0.1代表遺傳距離

2.2.6 AhLTN蛋白三級和四級結構預測

利用在線軟件Swiss Model[19-20]，以蛋白數據庫PDB(http://www.rcsb.org/)中的3a0c(PDB ID)的晶體結構為模板得到了AhLTN的三級結構模型，再使用PyMOL軟件繪制了AhLTN的三維立體結構(圖5),AhLTN四級結構是由兩個單體組成的同二聚體，兩個單體的C-末端的β-片層進行了交換，增強了亞基間的結合力(圖5-A)。兩個亞基采用β-棱鏡II折疊方式形成[21]，各由3個亞結構域組成(圖5-C)，其中每一個亞結構域是由3～4個反平行的β-片層組成，構成了三棱鏡的3個面，3個保守的色氨酸殘基Trp76，Trp108和Trp136分別位于3個面上，且將它們非極性的側鏈指向內部，形成了棱鏡的疏水核心(圖5-B)。此外，三棱鏡每個面上都有糖基結合位點(CBS)，含保守的甘露糖結合基序QXDXNXVXY(其中X代表任何一種氨基酸殘基)，如圖5-C所示(兩個亞基的甘露糖結合位點分別用紅色或綠色示意)，這些結合位點在凝集素的碳水化合物識別過程中起著決定作用。

白底黑字表示不同的氨基酸；白底紅字表示相似的氨基酸；紅底白字表示相同的氨基酸；三角形表示甘露糖結合位點。AhLTN的二級結構示意圖位于比對圖最上方，箭頭示意β-折疊

圖4不同物種間凝集素序列的比對及AhLTN的二級結構示意圖

Figure 4 Comparation of lectins in different species and secondary structure of AhLTN

3 討論與結論

在此項研究中，我們首次成功克隆出異葉天南星的Ahltn基因的ORF片段，并利用了一系列生物信息學軟件對Ahltn基因編碼的蛋白性質和結構進行了分析。根據異葉天南星轉錄組數據，該基因在根、莖和葉中表達值(FPKM)分別為0.3、0.16和0.06，其中在根中表達較多，但總體表達量都很低。Ahltn讀碼框編碼186個氨基酸。AhLTN的三級結構富含β折疊，呈“三棱鏡”型，3個保守的色氨酸位于中心，構成了疏水核心，并且三棱鏡每個面上所含的甘露糖結合位點決定了AhLTN與D-甘露糖獨特的結合性質，而不同腫瘤細胞表面集中分布有不同的糖基，所以進一步的研究應集中在AhLTN基因編碼蛋白的表達與純化以及純化的蛋白對不同腫瘤細胞的影響。

A:AhLTN二聚體模型，藍色和紅色各示意一個單體；B:球形示意3個保守的色氨酸殘基Trp76、Trp108和Trp136；C:紅色或綠色示意2個亞基的甘露糖結合位點。AhLTN的三級結構模板為3a0c，兩者的序列一致性為50.49%；序列相似性為42%；覆蓋率為55%(S35-G139)

圖5 AhLTN的同二聚體結構模型

Figure 5 The structure model of AhLTN homodimer

近些年來，凝集素作為抗腫瘤藥物的應用前景受到人們的廣泛關注，它們獨特的糖結合性質以及它們凝集細胞和沉淀多價碳水化合物的能力一直被人們挖掘，它們有望與癌細胞表面糖復合物結合而導致特定癌細胞的凋亡[18]，蓖麻毒蛋白是由A、B二條肽鏈構成的典型的植物凝集素，其中B鏈與細胞表面的半乳糖結合后將A鏈釋放，A鏈進入細胞內與核糖體亞基中的RNA結合，致使細胞停止合成蛋白質而死亡[22]。隨著腫瘤中日益增多的蓖麻毒蛋白結合位點被發現，用天然未加修飾的凝集素來治療腫瘤已經成為一種新的趨向。不同的凝集素分子與不同的糖基特異性結合，鮑錦庫[11]用7種不同的凝集素來分別標記卵巢漿液囊腺瘤和漿液囊腺癌，結果發現有些凝集素特異性地與良性腫瘤細胞結合，而另外的一些只與惡性卵巢漿液囊腺癌細胞發生結合，這種現象說明由于惡性程度不同的卵巢上皮的糖復合物不同，導致凝集素在不同惡性程度腫瘤上的標記也不同，所以用凝集素來鑒定腫瘤惡性程度是一個重要可行的方法。隨著基因工程技術的發展，許多植物中的凝集素已經可以在體外高效的表達和純化，并發展為腫瘤標記物或抗腫瘤藥物。本研究將為天南星科凝集素開發為抗腫瘤臨床藥物或藥物載體奠定基礎。