人RPS6KA3基因及蛋白質的生物信息學分析

唐 乖， 楊 越， 朱家佳， 龍鼎新

(南華大學 公共衛生學院， 衡陽 421001)

核糖體蛋白S6激酶A3基因(ribosomal protein S6 kinase A3，RPS6KA3)又稱為RSK2、p90RSK2、S6K-α-3或MAPKAPK-1B，位于X染色體p22.12，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶RSK2[1-2]。核糖體S6激酶2(ribosomal S6 kinase2, RSK2)屬于Ras-MAPK信號通路下游的90 ku 核糖體S6激酶家族(ribosomal S6 kinase，RSK)[3-4]。RSKs家族包含 4 個亞型(RSK1-4)及 2 個結構同系物(MSK1/2)[5]，該家族成員具有高度的序列同源性[6](約75% ～ 80%的氨基酸序列是相同的)，只有兩個功能不同的激酶結構域[7-8]。RPS6KA3通過磷酸化細胞死亡相關蛋白激酶(Death associated protein kinase，DAPK)[9]、活化T細胞核因子3(Nuclear factor of activated T-cells，NFAT3)[10]、熱休克蛋白27(Heat shock protein，Hsp27)[11]等一系列細胞因子[3, 12]，在細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬及細胞周期的調控等多項細胞生命活動中起關鍵作用[8]。研究發現RPS6KA3在細胞增殖、轉化等過程中發揮重要作用，并與癌癥等多種疾病的發生發展過程密切相關[13]。已證實，RPS6KA3基因的功能缺失突變會引起科-勒二氏綜合征(Coffin-Lowry syndrome，CLS)——一種罕見的神經退行性疾病[12, 14-15]。

為了深入研究人RPS6KA3基因的性質和功能，本研究擬采用生物信息學方法，對人RPS6KA3基因及其編碼蛋白的結構特點以及與其潛在相互作用的基因和蛋白進行預測分析，揭示其理化性質及功能信息，有利于了解其在疾病發生發展中的生物學作用，可為該基因的生物學功能及作用機制的深入研究奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 數據的來源

從在線數據庫NCBI中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)獲取人RPS6KA3基因(Gene ID: 6197)相關序列和RPS6KA3蛋白質的氨基酸序列信息(NP_004577)。

1.2 方法

利用Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線軟件預測潛在核心啟動子；利用Ensembl[16]數據庫(http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/)獲得RPS6KA3的染色體圖譜。在NCBI數據庫中，使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)進行同源搜索，獲得其它物種的RPS6KA3序列，采用最大似然法(maximum likelihood, ML)對不同物種RPS6KA3蛋白序列進行分析，隨后利用MEGA6.06軟件構建系統進化樹。應用NCBI的UniGene數據庫中EST(Expressed Sequence Tag)結果對RPS6KA3在正常組織及癌變組織中的表達情況進行預測分析。應用PSORT II Prediction[17](https://psort.hgc.jp/form2.html)在線數據庫對RPS6KA3進行亞細胞定位。采用在線數據庫GeneMANIA[18-19](http://genemania.org)構建RPS6KA3與其他基因之間的相互作用網絡圖。將人RPS6KA3蛋白質序列(NP_004577)提交到Expert Protein Analysis System(ExPASy)[20]數據分析系統中，使用在線分析軟件ProParam[21](http://web.expasy.org/protparam/)，對RPS6KA3蛋白質的分子式、分子質量、理論等電點、酸堿性及穩定性等物理化學特性進行預測分析。使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線預測軟件分析RPS6KA3蛋白質的親水性/疏水性；利用在線軟件SignalP4.1 Server[22](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、核定位信號(nuclear localizationsequence, NLS)Mapper[23](http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)和TMHMM Server version 2.0[24](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析RPS6KA3有無切割位點和信號肽、核定位信號及跨膜區域。用在線分析軟件NetPhos 3.1 Server[25](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )對人RPS6KA3蛋白磷酸化位點進行分析。應用NCBI的Conserved domain數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struct-ure/cdd/wrpsb.cgi)分析結構域。使用SOPMA[26](http://npsa-pbil.ibcp.fr/)、Swiss-Model[27](http://swissmodel.expasy.org)和The Structure Analysis and Verification Server[28](http://services.mbi.ucla.edu/SAVES)對蛋白質的二級結構、三級結構及拉曼圖進行預測分析；采用String[29](http://string-db.org/)對相互作用蛋白質進行預測分析。各數據庫軟件參數如無特別說明均取默認值。

2 結果與分析

2.1 人RPS6KA3基因啟動子預測

利用Neural Network Promoter Prediction對人RPS6KA3基因潛在核心啟動子的位置進行在線預測(表1)，結果發現其在 2820～2870 bp 位置處的得分值最大(0.99)，推測此處為潛在核心啟動子位置的可能性最大。

2.2 人RPS6KA3基因結構分析

人RPS6KA3基因位于X染色體上(Xp22.12)，見圖1，大小為7723 bp，共有28個外顯子區域及27個內含子，編碼740個氨基酸的蛋白質[12]。其編碼蛋白核糖體S6激酶2(ribosomal S 6 Kinase 2，RSK2)是一種生長因子調節的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在Ras-MAPK信號通路中發揮重要作用[30-31]。

利用NCBI數據庫中的BLAST對RPS6KA3蛋白序列進行BLASTp 搜索，獲得其他物種的RPS6KA3氨基酸序列，選取Identity較高的序列，隨后運用MEGA6.06軟件構建系統進化樹(圖2)。利用NCBI 中的BLASTp對人RPS6KA3蛋白序列進行分析發現，食蟹猴 (Macaca fascicularis)的蛋白序列與人RPS6KA3的蛋白序列的相似性最好；從系統進化樹中可以看到，物種被分為兩個大分支，其中人、食蟹猴及白頰長臂猿聚在一個分支內，同源性最高。

表1 人RPS6KA3基因啟動子預測結果

圖1人RPS6KA3基因位于染色體Xp22.12上

Figure 1 Human RPS6KA3 gene was located on chromosome Xp22.12

圖2 人RPS6KA3基因的系統進化樹Figure 2 The phylogenefic tree of human RPS6KA3 gene

2.3 人RPS6KA3的組織表達特異性和亞細胞定位預測

根據NCBI的UniGene數據庫中的EST預測結果，可知RPS6KA3在如下正常組織中均有表達，拷貝數分別為：肌肉112、甲狀腺128、肝臟82、心臟22、肺47、乳腺59、胃62、食管49、膀胱33，其在甲狀腺中的拷貝數最高。由此推測，RPS6KA3在多種組織中均有表達，特異性較低。使用PSORT II 亞細胞定位分析發現，RPS6KA3蛋白定位于細胞質的可能性最大(65.2%)，其次分別為細胞核(30.4%)和液泡(4.3%)。據此推測，RPS6KA3主要存在于細胞質中，也可能動態存在其他亞細胞結構中并發揮作用。

2.4 基因相互作用分析

應用GeneMANIA在線搜索與RPS6KA3基因存在相互作用的基因信息，構建基因間相互作用網絡圖。基因互作預測分析顯示，與RPS6KA3相互作用的基因主要有MAPK1、RPS6KA1、MAPK7、HMGN1、SRF等(圖3)。

2.5 人RPS6KA3蛋白特性分析

使用ProtParam分析發現：RPS6KA3蛋白含有740個氨基酸殘基，總分子式為 C3763H5900N1012O1097S27，相對分子量為 83 735.98 u，總原子數為11 799，理論等電點(pI, isoelectric point)預測為6.41，表明該蛋白為酸性蛋白質。在740個氨基酸殘基中帶正電荷的氨基酸殘基(Arg + Lys)和帶負電荷的氨基酸殘基(Asp + Glu)的總數分別是90和97，RPS6KA3基因CDS區氨基酸組成如圖4所示。消光系數(M-1cm-1γ=280 nm)為80 510，其不穩定系數為42.80(>40考慮為不穩定)，屬于不穩定類蛋白質，且其在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h。脂肪系數為 85.65，總平均親水系數(Grand average of hydropathicity, GRAVY)為 -0.338，表明該蛋白是親水性蛋白。

圖4 人RPS6KA3基因CDS序列氨基酸

進一步應用ProtScale在線親/疏水性軟件，按其默認的算法預測，獲得 RPS6KA3 蛋白的親/疏水性序列分析圖譜(圖5)。正值越大表明該氨基酸的疏水性越強，負值越大表明該氨基酸的親水性越強，數值介于-0.5～0.5之間的主要為兩性氨基酸。由圖5可知，該蛋白質存在兩個親水性最強的位點，分別是位于第458位的精氨酸(Arg)和第459位的天冬氨酸(Asp)，分值為-2.878；疏水性最強的位點是位于第608位的亮氨酸(Leu)，分值為2.100。ProtScale分析的732個氨基酸(5～736)中有63.80%(467個)分布在低分值區，總得分為-418.046；35.38%(259個)分布在score>0區，總得分為160.194。這表明RPS6KA3存在大量親水域，屬于親水性蛋白質。預測結果與理化性質中的親/疏水性結果一致。

圖5 人RPS6KA3親水性/疏水性分析

利用信號肽預測軟件SignalP 4.1 Server在線分析RPS6KA3蛋白質的氨基酸序列(圖6)，Cut-off值設為0.450。其中C為剪切位點打分，最大值為0.110；Y為信號肽打分，最大值為0.110；S為綜合剪切點打分，最大值為0.119；S-mean和D-mean值分別為0.105、0.108，由以上數據可知，人RPS6KA3蛋白不存在切割位點及信號肽序列，提示該蛋白不是分泌蛋白。進一步應用cNLS Mapper分析其核定位序列發現，在RPS6KA3蛋白質中存在一段序列為“FGKVFLVKKISGSDARQLYAMK VLKKATLK(79-108)”的NLS，其得分值為5.1分，高于設定的閾值(5分)。

圖6 人RPS6KA3蛋白的信號肽分析

使用TMHMM Server. 2.0對人RPS6KA3蛋白質的跨膜區進行預測與分析，結果發現RPS6KA3不存在跨膜區域(圖7)，屬于非跨膜蛋白。其中RPS6KA3蛋白定位于膜外(outside)的概率幾乎為100%，定位于膜內(inside)及跨膜區域(transmembrane)的概率幾乎為0。多肽鏈中跨膜區域所在的位置用加粗的紫色線來標識，由于RPS6KA3蛋白無跨膜區域存在，所以在紫色粗線上并未顯示相應標記。

圖7 人RPS6KA3蛋白跨膜結構分析

用NetPhos 3.1 Server對RPS6KA3翻譯后修飾情況進行在線分析，發現RPS6KA3蛋白有多個潛在的磷酸化調節位點存在(圖8)，這些磷酸化調節位點主要位于絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)上，表明RPS6KA3通過被絲氨酸、酪氨酸及蘇氨酸激酶磷酸化來實現其功能調控作用。

圖8 人RPS6KA3蛋白磷酸化位點

h：α-螺旋；e：延伸鏈； t：β-轉角；c：無規卷曲

圖9人RPS6KA3二級結構預測

Figure 9 Secondary structure prediction of human RPS6KA3

通過SOPMA對人RPS6KA3蛋白質所形成的二級結構進行預測分析(圖9)，構象狀態選擇3(Helix，Sheet，Coil)，相似性閾值選擇8。在RPS6KA3蛋白質的二級結構中，α-螺旋(h所示區域)占41.62%(308/740)，延伸鏈(e所示區域)占13.38%(99/740)，β-轉角(t所示區域)占8.11%(60/740)，無規則卷曲(c所示區域)占36.89%(273/740)。由此可知，RPS6KA3蛋白二級結構最大量元件是α-螺旋，無規則卷曲、延伸鏈、β-轉角則散在分布于整個蛋白質結構中。

應用NCBI的Conserved domain數據庫預測分析RPA6KA3蛋白，發現其屬于PKc_like超家族，含有2個功能不同的催化結構域(STKc_RSK_N和STKc_RSK_C)，它們可將ATP上的γ-磷酸基團催化轉移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，從而使蛋白底物磷酸化(圖10)。

圖10人RPS6KA3蛋白保守結構域

Figure 10 Conserved domain of human RPS6KA3

采用結構預測軟件SWISS-MODEL預測RPS6KA3蛋白質的三級結構。首先將RPS6KA3的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL，得到4個三級結構的預測信息(表2)；然后再利用The Structure Analysis and Verification Server 對預測獲得的模型進行拉曼圖分析，進一步驗證獲得的預測模型的可靠性(圖11)。表2展示了4種預測結果所選用的模板(Model)、序列相似度(Sequence Similarity)、預測范圍(Range)、覆蓋度(Coverage)及拉曼圖分析中處于不合理區域氨基酸的比例(Residues in disallowed regions)等。圖9展示了預測獲得的4種蛋白質模型的三級結構、同源蛋白質相似性波形圖及拉曼圖。在拉曼圖中區域由白到紅，顏色越深則表明該區域二面角越合理。

▲：甘氨酸；■：除甘氨酸外的其他氨基酸

圖11人RPS6KA3三級結構預測結果及拉曼圖分析

Figure 11 Tertiary structure prediction and Ramachandran
plot analysis of RPS6KA3 in human

2.6 人RPS6KA3相互作用蛋白質的預測分析

應用蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein, PPI)在線分析數據庫STRING，對人RPS6KA3蛋白質間的相互作用進行預測分析，設置為高置信度0.7，構建RPS6KA3蛋白相互作用網絡(圖12)。得到10個與RPS6KA3相互作用緊密的蛋白信息及預測得分值(表3)，這些蛋白質彼此之間存在緊密的相互作用關系。

表2 RPS6KA3預測三級結構信息

圖12 與人RPS6KA3蛋白質相互作用的蛋白質預測

表3 與人RPS6KA3相互作用可能性較大的10種蛋白質

3 討論與結論

生物信息學(Bioinformatics)是一門由生物學、數學、信息科學以及計算機科學等多學科相結合，以計算機為工具對生物信息進行加工、存儲、分配、分析解釋等，并綜合運用計算機科學、數學和生物學等學科的各種工具來理解和闡明大量數據所包含的生物學意義的一門交叉性學科[32-33]。

本研究對人RPS6KA3基因及其蛋白進行生物學分析，結果顯示其基因存在15個潛在啟動子，其中在 2820～2870 bp 位置處得分值最大0.99，表明其為潛在核心啟動子位置的可能性最大。人RPS6KA3基因定位于X染色體長臂上，共編碼740個氨基酸組成的多肽；通過對不同物種間的序列進行同源比對分析可知，不同物種間的序列相似度較高，提示其在進化過程中相對保守，說明其由于具有重要的功能作用而在進化過程中得以保留。基因互作預測分析表明，與RPS6KA3相互作用的基因主要有MAPK1、RPS6KA1、MAPK7、HMGN1和SRF等；人RPS6KA3基因存在多個磷酸化位點，其編碼的蛋白是一個不穩定的水溶性蛋白，其分子量為83 735.98 u，等電點為6.41，蛋白質結構主要由α-螺旋和無規則卷曲組成，不含切割位點，無明顯信號肽及跨膜結構，說明RPS6KA3不參與物質的跨膜運輸。蛋白質相互作用預測表明，與RPS6KA3相互作用的蛋白主要是MAPK1、MAPK3、MAPK7等MAPK信號通路相關蛋白，TSC1、TSC2等mTOR信號通路相關蛋白及蛋白合成相關蛋白等。

本研究針對人RPS6KA3基因及其編碼蛋白的生物學特性進行系統分析，構建了RPS6KA3的系統進化樹，分析了RPS6KA3蛋白的理化性質、空間結構特點、組織學特異性、亞細胞定位以及與其存在相互作用蛋白等，為全面認識RPS6KA3和深入研究其生物學功能提供了一定的基礎。