敲除PLAC8蛋白對人胚腎細胞增殖的影響

秦緒慧, 馬立群, 歐陽聰, 王海霞, 浦易之, 薛 璐

(中南民族大學 生命科學學院 醫學生物研究所 武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室， 武漢 430074)

胎盤特異蛋白8 (Placenta special gene 8，PLAC8)又稱onzin或C15，是一種高度保守并富含半胱氨酸，有著獨特結構并在組織中特異性表達的蛋白。PLAC8首次發現是在人樹突狀細胞中，定位于染色體的4q13-4q21區域。PLAC8含有5個外顯子，mRNA全長829 bp，編碼115個氨基酸，蛋白分子質量為12.4 ku[1-2]。廣泛分布于真核生物中的PLAC8不含信號肽，但是在一些哺乳動物中有類似限制酶位點的信號肽。PLAC8在不同物種中氨基酸序列差異較大，說明在進化早期，PLAC8的進化并不穩定[1,3]，也提示了PLAC8在不同物種中可能承擔著不同的功能角色。

PLAC8的表達調控涉及多種腫瘤的發生與發展，與細胞的凋亡、增殖及分化等生理過程都有著十分密切的關系[1-2]。在細胞分化方面，有研究發現PLAC8是棕色脂肪細胞分化所必需的蛋白，如果PLAC8蛋白缺失可能會導致寒冷耐受不良癥、遲發性肥胖和棕色脂肪細胞功能受損[4]。Jimenez-Preitner等發現，在小鼠體內，PLAC8在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中均有表達，并且發現PLAC8敲除小鼠會產生遲發性肥胖，棕色脂肪分化異常，產熱能力下降[5]。除此之外PLAC8也廣泛存在于免疫細胞之中，尤其是巨噬細胞與中性粒細胞。如果在成體上敲除該基因，雖然不會影響吞噬細胞的吞噬作用，但是其吞噬效率會降低，這提示我們PLAC8可能在免疫過程中發揮著十分重要的作用[2,6]。Ledford等發現，PLAC8基因敲除小鼠雖然發育的正常，但是在噬中性粒細胞的功能上表現出明顯的缺陷[7]。在調控細胞增殖方面，Zou[8]和Uehara[9]等用人胰腺細胞系體外實驗證明，通過siRNA敲除PLAC8蛋白的表達能抑制胰腺癌細胞的增殖。在結腸癌的相關研究中，Li等在結腸癌細胞系中敲除內源PLAC8后發現腫瘤的體積減小，這一過程可能是通過改變ERK2的表達來實現的[10]。與之相反的是，Zou等通過細胞功能實驗研究證明，在肝癌細胞中，PLAC8下調會促進細胞存活，促使細胞增殖進而促進腫瘤的形成[9]。由此可見，PLAC8蛋白在不同腫瘤來源細胞系中對增殖具有不同的調控模式，值得進一步研究。

人胚胎腎細胞極少表達細胞外配體所需的內生受體，且比較容易轉染，是一個十分常用的表達研究外源基因的工程細胞株。因此在本課題中，我們利用流式細胞術與CRISPR/Cas9基因編輯技術相結合的方法在293T細胞系上進行PLAC8蛋白敲除的研究，最終獲得了PLAC8蛋白敲除人胚腎細胞系。隨后的一系列功能實驗表明，敲除細胞系的增殖相比野生型有明顯的下降。進一步地，我們發現PLAC8蛋白的表達下降同時伴隨著AKT，ERK2，RAF-1，C-MYC等基因的表達水平改變，提示在293T細胞中，PLAC8可能通過ERK/MAPK信號通路來調控細胞增殖。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人胚腎細胞株 (293T)購于武漢大學細胞庫，PX458質粒、感受態細菌Stbl3、10×T4 Ligation Buffer、T4 連接酶購于武漢淼靈生物，T4 PNK、10×TaqBuffer、dNTP、rTaq酶購于TaKaRa，Fast Digest BpiI、Fast AP、10×Fast Digest Buffer、Protein Ladder購于Thermo Scientific，DTT購于Biosharp，Endo-free Plasmid Mini Kit購于Omega，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購于AxyGen，PBS購于HyClone，血清購于ScienCell，雙抗、胰酶、Lipofectamine 3000試劑購于Invitrogen, BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、Tween-20、Beyo ECL Plus、上樣緩沖液購于碧云天公司，甲醇 (分析純)、氯化鈉、甘氨酸、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈣購于國藥集團化學試劑有限公司，Anti-PLAC8抗體購于Cell Signaling Technology，Anti-β-Actin、HRP-goat anti mouse IgG、HRP-goat anti rabbit IgG購于康為世紀。引物合成、基因測序交由武漢擎科生物公司完成。

1.2 sgRNA寡核苷酸鏈序列及檢測引物的設計

首先使用CRISPR在線sgRNA設計網站 (http://crispr.mit.edu/)，分別對PLAC8基因5個外顯子上的sgRNA的潛在靶點進行預測。根據評分系統，選擇得分較高的靶點序列，分別在PLAC8的外顯子2和外顯子3上設計2個sgRNA (S1及S2)，見圖1。需要指出的是，若sgRNA的序列第一個堿基不是G，則需要在前面補一個G以取得更好的編輯效率。以該sgRNA序列為模板，設計其互補鏈，然后分別在sgRNA5′ 端添加CACCG，互補鏈5′ 端添加AAAC，3′ 端添加C，以此人工合成BpiI酶的酶切位點。sgRNA序列見表1。

為確定細胞是否被編輯，需要對基因組進行測序檢測。因此我們使用軟件Primer Premier 5分別在兩個sgRNA潛在靶點的上下游200～300 bp處各設計了一對檢測引物 (PLAC8-AF/AR，PLAC8-DF/DR)，見圖1。引物序列見表2。

圖1 PLAC8基因結構特征及sgRNA設計

1.3 PX458-sgRNA表達載體的構建和鑒定

選擇PX458質粒作為載體，首先將含有質粒的保存菌液用LB液體培養基在37 ℃，180 r/min的搖床中培養14 ～ 16 h，用質粒小提試劑盒提取PX458質粒，測濃度，置于-20 ℃備用。

用Fast DigestBpiI酶切割質粒PX458，使其線性化，然后用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后用凝膠成像系統檢測片段大小及線性化效率，然后進行切膠回收，測濃度，置于-20 ℃備用。

表1 PLAC8 sgRNA引物序列

表2 PLAC8 敲除細胞系檢測引物

將合成的sgRNA寡核苷酸單鏈梯度退火為雙鏈，用T4 DNA連接酶與線性化的PX458連接，然后轉化到stbl3感受態細胞中，挑取陽性單克隆菌落，將菌液做菌落PCR，將帶有正確條帶的菌落送測序驗證是否構建成功。

1.4 細胞培養和細胞轉染

293T細胞培養在含5% CO2，37 ℃恒溫培養箱中。轉染前24 h取對數期細胞以5×105/孔的細胞密度接種到6孔板中，細胞密度長到70%～80%時開始做轉染。首先將細胞培養液換成不含血清的opti-MEM培養基饑餓30 min，然后將5 μL p3000試劑及2.5 μg的PX458-sgRNA重組質粒先后加入125 μL的opti-MEM中。與其同時，將7 μL的lipo3000試劑加入到另一管125 μL的opti-MEM中，邊加邊混合，靜置5 min。然后將兩管轉染組分輕輕混合，再靜置20 min后加入到事先饑餓好的細胞中。5 h后，換上含10%胎牛血清的完全培養液繼續培養，24 h后觀察熒光。

1.5 流式細胞儀分選

將準備分選的細胞用胰酶消化下來，1000 r/min離心5 min的條件下用PBS洗2次，然后取1 mL準備好的含1%胎牛血清的PBS將細胞吹打混勻，把細胞過濾膜分散成單細胞，收集在滅菌的15 mL離心管中，上機前用1 mL槍頭輕輕混勻，準備好上機分選。上機后選擇single模式，根據陰性對照調節電壓，設置陽性門后，將帶有綠色熒光的單個細胞打到事先加入200 μL含20%胎牛血清和2%雙抗的完全培養基的96孔板中。

1.6 單細胞培養

將篩選出來的細胞養在含有20%血清和2%抗生素的完全培養基培養的96孔板中，約15 d便可以將細胞轉到24孔板中，待細胞密度達到70%～80%就可以將細胞轉入12孔板中，最后將細胞轉到6孔板中繼續培養。

1.7 測序檢測

收取6孔板中的細胞提取基因組，送至武漢擎科生物公司進行測序。測序使用的引物為PLAC8-AF或PLAC8-DF。通過與野生型細胞基因組做比較，篩選出被編輯過的細胞，并將該細胞擴大培養后凍存，以便進行后續的實驗研究。

1.8 Western Blot檢測編輯效率及蛋白表達

提取被編輯細胞的蛋白質，以野生型293T細胞為對照，檢測PLAC8及MAPK信號通路相關蛋白的表達。根據待檢測蛋白分子量用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10%～15%的分離膠和5%的濃縮膠。濃縮膠30 mA、80 V跑50 min，分離膠30 mA、100 V跑1.5 h。電泳完畢后，200 mA、100 V濕法轉膜1 h。 轉膜后，用5%的脫脂奶粉將轉好的膜封閉1 h，用TBST洗3次后，孵育一抗 (一抗稀釋比例為1∶1000)，4 ℃過夜。接著用TBST洗3次，每次10 min，室溫下敷二抗1 h (二抗稀釋比例為1∶10 000)，TBST洗3次，每次10 min，TBS洗2次，每次5 min，用ECL顯影，觀察結果。所有的Western Blot實驗均重復3次，并選取最具有代表性的結果進行呈現。

1.9 MTT檢測細胞生長速度

取對數生長期被編輯的細胞系和野生型293T細胞，用PBS洗2次，用胰酶將細胞消化下來，1000 r/min離心5 min。加入1 mL 完全培養基將細胞吹散，置于含4 mL培養基的中皿里，混合均勻。取20 μL 細胞液置于1.5 mL 離心管中，再加入20 μL臺盼藍染液和60 μL PBS，用槍頭混合均勻。取10 μL滴在血球計數板上，在顯微鏡下計數，重復3次，取平均數。

以2000個細胞/孔的密度將細胞鋪在96孔板中，重復6個孔，鋪5個96孔板。一天測一個96孔板。細胞貼壁后，在有細胞的孔中加入20 μL 5 mg/mL的MTT試劑，不用換液。4 h后除去孔內的完全培養基，加入150 μL DMSO。在酶標儀上震蕩10 min，490 nm檢測OD值，對所得數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 敲除PLAC8基因的293T細胞株的構建

為了成功構建打靶載體，我們用T4 DNA連接酶將合成的sgRNA單核苷酸鏈退火連成雙鏈，然后與線性化的PX458連接，轉化到stbl3感受態中，37 ℃培養箱中過夜培養，挑取單克隆菌落，做菌落PCR后，將有正確條帶的菌液進行測序。測序結果顯示，sg-RNAS1、S2分別正確插入到PX458載體中。

接下來，我們用lipo3000轉染試劑將構建好的兩個打靶載體分別轉染到293T細胞中，48 h后汞燈觀察細胞內的綠色熒光，判斷轉染效率 (圖2)。由圖2可知，PX458-sgRNA-S1和PX458-sgRNA-S2這兩個質粒都成功轉染到293T細胞中，轉染效率約為80%。

A: PX458-sgRNA-S1質粒轉染細胞的熒光視野 (100×)；b：PX458-sgRNA-S2質粒轉染細胞的熒光視野(100×)；c：PX458-sgRNA-S1質粒轉染細胞的明場視野(100×)；d：PX458-sgRNA-S2質粒轉染細胞的明場視野 (100×)

圖2敲除PLAC8基因的293T細胞株的構建

Figure 2 Construction ofPLAC8 knockout 293T cells a and c detection
of GFP via fluorescence microscopy after PX458-sgRNA-S1
transfection (green, PLAC8; 100×)

2.2 細胞株的鑒定

為了獲得單一編輯的細胞，在載體成功轉染至293T細胞后，利用流式細胞儀將轉染后帶有綠色熒光的細胞以每孔一個細胞的密度篩選至96孔板中培養，并通過基因組測序鑒定被編輯的細胞系。測序結果 (圖3-a)顯示，轉染sgRNA2篩選出來兩株細胞株基因組紅色方框處發生了編輯，并出現了明顯的套峰 (圖3-b)，分別命名為KD1和KD2。為了進一步驗證該細胞是否成功編輯，使用錯配酶T7E1進行驗證，以KD2細胞株為例，結果顯示其基因組能夠被錯配酶酶切成178 bp和299 bp兩個小片段 (圖 3-c)。以上實驗共同證明KD1、KD2細胞系的基因組已被成功編輯。

為了進一步檢測KD1、KD2細胞株基因組編輯的效率，對KD1、KD2細胞株的總蛋白進行了Western Blot實驗，用野生型293T細胞做陰性對照。結果顯示KD1、KD2細胞株中的PLAC8蛋白已經被完全敲除 (圖 3-d)。

A： KD1、KD2與WT的基因組序列對比；b:KD1、KD2基因組測序峰圖；c:以KD2為例，編輯細胞株錯配酶驗證結果，其中P為陽性對照 (Genloci CruiserTM基因敲除檢測試劑盒中自帶的陽性對照)，KD2為被檢測的敲除細胞系，WT為陰性對照，M為DNA Marker DL2000；d:Western Blot結果

圖3 PLAC8敲除細胞株的驗證

Figure 3 Identification of PLAC8 knockout cell line

2.3 PLAC8蛋白表達下調對293T細胞增殖的影響

將KD1、KD2細胞系與野生型293T細胞系，分別取對數期細胞以2000/孔的細胞密度接種到96孔板中，用5 mg/mL的MTT檢測細胞的生長速度并分析數據。結果顯示KD1、KD2細胞系的生長速度均明顯慢于WT細胞系，具有統計學意義 (圖 4-a)。

A:MTT結果圖；b:與細胞增殖相關的4個基因在Plac8基因敲除細胞系 (KD2&KD1) 和野生型 (WT)中蛋白的表達量

圖4 PLAC8表達下調對293T細胞增殖的影響

Figure 4 Down-regulated PLAC8 inhibits proliferation of 293T cells

為了進一步分析PLAC8 敲除影響細胞增殖可能的分子機制，通過Western Blot實驗檢測了一系列細胞增殖相關基因的蛋白表達水平的變化。結果顯示 (圖 4-b)，能促進細胞生長和增殖的蛋白激酶B/AKT及核內原癌基因C-MYC表達下調，MAPK上游激酶RAF-1和胞外調節蛋白激酶ERK2表達上調。因此我們推測敲除PLAC8蛋白能改變ERK/MAPK信號通路中關鍵基因的表達變化，從而抑制細胞的增殖。

3 討論

PLAC8是一種在多種癌細胞中表達并能調控腫瘤發生發展的蛋白。目前，國內外在細胞水平上研究PLAC8時都會用到基因編輯細胞系，其構建方式大多是使用CRISPR/Cas9基因編輯方法構建載體-sgRNA敲除重組質粒，再將該重組質粒導入病毒包裝細胞中，收集病毒上清液轉染細胞，然后用嘌呤霉素或者G418等抗生素進行篩選。通過提取基因組測序，篩選出敲除成功的細胞，再對敲除成功的細胞通過有限稀釋法將細胞分成單克隆，最后在96孔板中培養。但是以上的方法操作起來十分繁瑣，尤其是病毒實驗需要成熟的技術和高要求的平臺，有限稀釋法需要大量的重復性工作，也不能確保能將細胞全部分為單克隆。

在本課題中，我們首先利用流式細胞術與CRISPR/Cas9基因編輯方法相結合來解決構建基因編輯細胞系過程中病毒包裝轉染效率低下及篩選目的細胞繁瑣的瓶頸，以簡便、高效、無毒的方法獲得了PLAC8蛋白敲除人胚腎細胞系。后續的功能實驗結果顯示，在293T細胞系中，PLAC8蛋白表達下調會抑制細胞增殖，進一步的Western Blot實驗結果顯示，與野生型293T細胞相比，敲除PLAC8蛋白的293T細胞中，AKT，C-MYC基因的蛋白表達水平顯著下降，ERK2，RAF-1基因的表達水平顯著上升。AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶能夠促進細胞增殖和生長，抑制細胞凋亡，促進細胞侵襲和轉移[11-12]。RAF-1，ERK2和C-MYC是ERK/MAPK信號通路中的關鍵因子，RAF-1作為MAPK激酶激酶，激活后可以引起MAPK信號通路的活化，促使細胞增殖周期失調[13]。同時RAF-1的持續表達也可刺激抑制性因子P21cip1表達，使該因子與cdk2或cdk4結合增多而阻滯細胞周期，抑制細胞增殖[14]。ERK2是MAPK家族的一員，處于RAF-1的下游，調控信號通過ERK2從表面受體傳導至細胞核，調控核內的轉錄因子C-MYC表達，繼而影響基因轉錄，調控細胞增殖[14]。

綜上所述，我們推測在293T細胞中PLAC8可能是通過刺激AKT以及RAF-1-ERK2-C-MYC信號級聯通路調控細胞增殖。接下來我們還將通過后續蛋白水平上的實驗進一步來驗證其分子機制。本課題的研究一方面可將已證實可用的sgRNA用于后續編輯其他細胞系，另一方面也可以利用構建的敲除細胞系進行后續動物水平上的實驗，如裸鼠荷瘤實驗等，用以進一步研究PLAC8蛋白在腫瘤發生發展過程中的功能。