輪狀病毒NSP5真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及功能研究

陳林林, 周 艷, 林曉晨, 杜 靜, 劉 洋, 汪 藝, 李鴻鈞

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650118)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是導(dǎo)致嬰幼兒急性腹瀉的重要病原體之一，于1973年在嚴(yán)重腹瀉的嬰幼兒十二指腸切片及糞便樣本中首次被發(fā)現(xiàn)，且因其形似車輪，故被命名為輪狀病毒[1-3]。RV的流行和感染多發(fā)生在氣溫較低的秋冬季節(jié)，主要通過(guò)糞口途徑傳播。感染后常導(dǎo)致嬰幼兒患者產(chǎn)生腹瀉、嘔吐、發(fā)燒等癥狀，并伴隨嚴(yán)重脫水、體內(nèi)電解質(zhì)代謝紊亂等并發(fā)癥，在全球范圍尤其是在南亞、中非等廣大發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)貗胗變旱慕】礫4-5]。

RV屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬。RV無(wú)包膜結(jié)構(gòu)，其基因組由11段不連續(xù)的雙鏈RNA組成，分別編碼著6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6)，在RV宿主特異性、基因組的復(fù)制和翻譯、宿主胞質(zhì)內(nèi)病毒池(viroplasms)的形成及病毒增殖和釋放等環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[6-8]。此外，依據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白VP6的抗原特異性，可將RV分成8組，且因結(jié)構(gòu)蛋白VP4和VP7的差異，RV又被細(xì)分成37個(gè)P型與27個(gè)G型[9-13]。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5為重要的胞質(zhì)磷蛋白，具有高度保守的氨基酸序列[14-15]。在RV感染細(xì)胞后，NSP5在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)并參與形成病毒池結(jié)構(gòu)，調(diào)控RV的復(fù)制和包裝，但具體機(jī)制還不完全清楚[16]。

本研究構(gòu)建了G1型RV的pEGFP-N2-NSP5真核表達(dá)載體，并通過(guò)蛋白印跡和間接免疫熒光驗(yàn)證了NSP5蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。此外，在將該載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，進(jìn)一步確認(rèn)了NSP5蛋白對(duì)RV增殖的促進(jìn)作用，對(duì)后續(xù)探究和揭示NSP5參與構(gòu)成病毒池的過(guò)程及在RV增殖中的調(diào)控機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

MA104細(xì)胞、pEGFP-N2真核表達(dá)載體、RV ZTR68(G1型)由本實(shí)驗(yàn)室保存；MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；新生牛血清(NBS)購(gòu)自北京民海生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；病毒核酸提取試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、SalI和T4連接酶購(gòu)自Thermo公司；One-Step RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；TRizol和Lipofectamine3000購(gòu)自Invitrogen公司；兔抗NSP5抗體購(gòu)自Genscript公司；鼠抗β-actin抗體購(gòu)自藥明康德公司；山羊抗RV(G1)抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體購(gòu)自Abcam公司；FITC標(biāo)記的驢抗兔抗體和驢抗山羊抗體均購(gòu)自IR公司；One-Step Probe qRT-PCR試劑盒購(gòu)自TransStart公司；引物和探針于GeneRay公司合成；熒光定量PCR儀(C1000)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中RV G1P[8]的NSP5序列(ACCESSION：KY446463)，通過(guò)Primer 5設(shè)計(jì)出含有EcoR I和SalI酶切位點(diǎn)的NSP5特異性引物(表1)。

表1 引物和探針

1.2.2 NSP5基因擴(kuò)增和鑒定

用病毒核酸提取試劑盒提取RV基因組RNA，再通過(guò)一步法RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出NSP5基因，反應(yīng)體系為2×1step buffer 25 μL，上下游引物各2 μL(10 μmol/mL)，RNA模板100～500 ng，RNAase-free水補(bǔ)足至50 μL；反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃再延伸10 min。 瓊脂糖凝膠電泳后回收NSP5目的條帶并測(cè)序鑒定。

1.2.3 pEGFP-N2-NSP5真核表達(dá)載體的構(gòu)建

限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和SalI分別對(duì)空載體pEGFP-N2及NSP5基因片段進(jìn)行雙酶切。酶切體系為pEGFP-N2/NSP5 1 μg，EcoR I 0.5 μL，SalI 0.5 μL，10×FD buffer 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。于37 ℃水浴酶切反應(yīng)20 min后，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并分別回收目的條帶。隨后，再將回收產(chǎn)物配制連接體系：pEGFP-N2 1 μL，NSP5 14 μL，T4連接酶1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，混勻后于16 ℃過(guò)夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α并涂布到卡那霉素(kanamycin)抗性的LB固態(tài)培養(yǎng)板上，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置并過(guò)夜培養(yǎng)。

挑取培養(yǎng)板中長(zhǎng)勢(shì)良好的單克隆菌落至中管(Kana：50 μg/mL)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定。特異表達(dá)重組蛋白NSP5的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N2-NSP5，構(gòu)建過(guò)程如圖1。

圖1 pEGFP-N2-NSP5重組質(zhì)粒構(gòu)建流程

1.2.4 pEGFP-N2-NSP5的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其表達(dá)水平檢測(cè)

MA104細(xì)胞接種至六孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～80%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染。分別以250 μL Opti-MEM稀釋1 μg重組質(zhì)粒和3.75 μL Lipofectamine 3000，再將質(zhì)粒稀釋液緩慢加至脂質(zhì)體稀釋液中，輕輕混勻并室溫孵育5～8 min。隨后將500 μL混合液緩慢滴加至六孔板中，37 ℃培養(yǎng)6 h后換成細(xì)胞生長(zhǎng)液，并分別于24～72 h觀察并檢測(cè)重組蛋白NSP5表達(dá)情況。

1)免疫熒光檢測(cè)。pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染后，分別于24、36、48和72 h取出細(xì)胞，以2%多聚甲醛(含0.5% triton X-100)固定；PBS清洗2次后，1%BSA封閉30 min；PBS洗2次后，37 ℃孵育兔抗NSP5抗體1 h；PBS洗3次后，37 ℃避光孵育熒光二抗(FITC標(biāo)記驢抗兔抗體)1 h；PBS洗3次后，37 ℃避光孵育DAPI 5 min；PBS洗3次后，于倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2)Western Blot檢測(cè)。pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染后，分別于24、36、48和72 h提取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)各樣品蛋白濃度。樣品蛋白與適量上樣緩沖液混勻后于100 ℃變性10 min。25 μg/孔經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離并通過(guò)40 V/2 h濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h后，以鼠抗β-actin抗體和兔抗NSP5抗體分別孵育膜2 h。洗膜3次后，以HRP標(biāo)記的抗鼠和抗兔二抗分別孵育膜2 h。清洗3次后進(jìn)行曝光反應(yīng)。

1.2.5 pEGFP-N2-NSP5的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其對(duì)RV復(fù)制影響的檢測(cè)

1)MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5 48 h后接種RV。48 h后取出細(xì)胞并于-20 ℃三凍三融，隨后4 ℃以8000 r/min離心20 min收獲RV上清并提取病毒樣品和RV標(biāo)準(zhǔn)毒株RNA。將標(biāo)準(zhǔn)毒株RNA以DEPC水進(jìn)行10倍比梯度稀釋并和RV樣品通過(guò)One-Step Probe qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。隨后用標(biāo)準(zhǔn)毒株濃度以10為底的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的Cq值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將RV樣品Cq值帶入標(biāo)曲方程，計(jì)算出相應(yīng)拷貝數(shù)。qRT-PCR體系為2× SuperMix 10 μL；上下游引物各(10 μmol/mL)0.4 μL；Enzyme Mix 0.4 μL；RNA Template 1 μL；Probe(10 μmol/mL)0.4 μL；RNAase-free水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃逆轉(zhuǎn)錄10 min；94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)45次。

2)MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5 48 h后接種RV并于接種16 h后用山羊抗RV抗體和FITC標(biāo)記的驢抗山羊二抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

3)MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5 48 h后接種RV，并分別在接種RV 0、4、8和12 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的分布狀態(tài)，以進(jìn)一步確認(rèn)重組蛋白NSP5是否參與并促進(jìn)RV復(fù)制。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSP5基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

RV基因組RNA經(jīng)NSP5特異性引物以一步法逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，NSP5基因片段電泳結(jié)果如圖2-a。隨后，對(duì)將NSP5克隆到pEGFP-N2載體并擴(kuò)大培養(yǎng)和抽提的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行NSP5的PCR擴(kuò)增(圖2-b)及雙酶切鑒定(圖2-c)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，NSP5特異性條帶與預(yù)期一致，故可確認(rèn)NSP5基因插入到質(zhì)粒pEGFP-N2中，但重組質(zhì)粒pEGFP-N2-NSP5能否表達(dá)NSP5蛋白仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 pEGFP-N2-NSP5的表達(dá)定位及重組蛋白表達(dá)量與時(shí)間的關(guān)系鑒定

重組質(zhì)粒pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞后，分別于轉(zhuǎn)染24、36、48和72 h后取出細(xì)胞做免疫熒光，并于倒置熒光顯微鏡下觀察特異性標(biāo)記紅色熒光的重組蛋白NSP5在細(xì)胞內(nèi)的分布及表達(dá)量與時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示，重組蛋白NSP5在MA104細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均有分布且主要集中在胞質(zhì)內(nèi)。其表達(dá)量在轉(zhuǎn)染初期隨時(shí)間而上升，在轉(zhuǎn)染48 h表達(dá)達(dá)到頂峰后即開(kāi)始下降(圖3-a)。同樣收取轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5質(zhì)粒24、36、48和72 h后的細(xì)胞并通過(guò)Western Blot檢測(cè)重組蛋白NSP5的表達(dá)情況。結(jié)果也說(shuō)明重組質(zhì)粒pEGFP-N2-NSP5可在MA104細(xì)胞中特異性表達(dá)重組蛋白NSP5，且其表達(dá)量也在轉(zhuǎn)染初期上升、在轉(zhuǎn)染48 h達(dá)到頂峰后開(kāi)始下降(圖3-b)。

a、b、c分別為RV-NSP5基因擴(kuò)增、pEGFP-N2和pEGFP-N2-NSP5基因擴(kuò)增及pEGFP-N2-NSP5雙酶切鑒定

a為pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞不同時(shí)間后的重組蛋白NSP5免疫熒光檢測(cè)(×200)；b為pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞不同時(shí)間后的重組蛋白NSP5 Western Blot檢測(cè)

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5對(duì)RV復(fù)制的影響

以RV標(biāo)準(zhǔn)毒株One-Step Probe qRT-PCR的Cq值為Y軸、標(biāo)準(zhǔn)毒株濃度以10為底的對(duì)數(shù)為X軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-a)：Y=-4.8205x+49.434，R2=0.9922。將RV樣品Cq值帶入標(biāo)曲后可求出對(duì)應(yīng)的RV拷貝濃度。3組不同處理的MA104細(xì)胞接種等量RV，并于接種后48 h分別收獲病毒上清。結(jié)果顯示，pEGFP-N2-NSP5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組收獲的RV拷貝濃度明顯高于空白組(Mock)和空載體pEGFP-N2轉(zhuǎn)染組(圖4-b)，說(shuō)明了重組蛋白NSP5可促進(jìn)RV在MA104細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。另一方面，MA104細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h后接種RV，并于接種16 h后檢測(cè)RV復(fù)制情況。免疫熒光結(jié)果顯示，pEGFP-N2-NSP5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中紅色熒光標(biāo)記的RV同樣顯著高于空白組(Mock)和空載體pEGFP-N2轉(zhuǎn)染組(圖4-c)，進(jìn)一步確認(rèn)了NSP5對(duì)RV復(fù)制的促進(jìn)作用。

a為RV G1標(biāo)準(zhǔn)毒株的qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；b為pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞48 h后接種RV并于48 h收獲RV上清且根據(jù)標(biāo)曲檢測(cè)出的RV拷貝數(shù)(*P≤0.01)；c為pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞48 h后接種RV并于16 h免疫熒光檢測(cè)RV復(fù)制狀況(×200)；d為pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞48 h及接種RV后0、4、8、12 h的GFP分布狀況(×400)

此外，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5 48 h并接種RV不同時(shí)間的GFP分布狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在未接種RV的細(xì)胞中，GFP呈彌散狀且較為均勻地分布在細(xì)胞內(nèi)。但當(dāng)細(xì)胞接種RV后，GFP開(kāi)始在細(xì)胞內(nèi)聚集并逐漸由彌散狀變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集，且點(diǎn)狀聚集隨著RV接種時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)不斷增多(圖4-d)，同樣說(shuō)明了重組蛋白NSP5參與并促進(jìn)RV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

3 討論與結(jié)論

A種輪狀病毒(Rotavirus，RV)是全球最為常見(jiàn)的食源性病原體之一，引起人類嬰幼兒超過(guò)90%的RV感染，并在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[18-21]。RV編碼多種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中NSP5是由病毒基因組第10或11段RNA編碼的重要調(diào)控蛋白。研究表明，NSP5的特異性下調(diào)可顯著降低病毒池的組裝及病毒基因組和蛋白的合成[22-24]。NSP5富含絲氨酸和蘇氨酸等多個(gè)修飾位點(diǎn)，通過(guò)翻譯后的多聚化、磷酸化及糖基化修飾而形成26～35 ku的不同蛋白亞型，這些亞型在RV的復(fù)制周期中可相互轉(zhuǎn)化并參與病毒增殖的多種機(jī)制[6,16]。RV感染宿主細(xì)胞后，其基因組的復(fù)制和病毒顆粒的裝配主要發(fā)生在胞質(zhì)中呈點(diǎn)狀分布的病毒池內(nèi)[25-27]。病毒池由結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP6及非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2、NSP5、NSP6等多種RV蛋白參與構(gòu)成[28-29]。盡管目前對(duì)于起始RV病毒池發(fā)生的機(jī)制尚不明確，但早有研究發(fā)現(xiàn)輪狀病毒SA11感染細(xì)胞2 h后即可檢測(cè)到具有自磷酸化特點(diǎn)的NSP5的合成。此外，Jeanette等發(fā)現(xiàn)病毒池的形成具有磷酸化依賴性，高度磷酸化的NSP5在和NSP2的相互作用中參與病毒池的裝配過(guò)程[7,30]。因此，深入研究NSP5在病毒池的形成及RV復(fù)制過(guò)程中的功能和作用機(jī)制不僅為揭示RV的感染和致病機(jī)理，而且為后續(xù)RV的相關(guān)治療均提供重要的理論依據(jù)。

工具質(zhì)粒pEGFP-N2具有高效轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)，且質(zhì)粒產(chǎn)生的優(yōu)化突變型GFP在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中可起到重要的示蹤作用。因此本研究利用該工具質(zhì)粒構(gòu)建出可特異性表達(dá)RV NSP5蛋白的真核表達(dá)載體，并確認(rèn)重組蛋白NSP5在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h表達(dá)達(dá)到頂峰。根據(jù)該重組質(zhì)粒的GFP基因和外源NSP5基因基于同一個(gè)啟動(dòng)子CMV的特點(diǎn)，我們觀察到當(dāng)RV感染宿主細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的GFP熒光從最初的彌散分布狀態(tài)變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集，說(shuō)明重組蛋白NSP5成功表達(dá)并參與RV的復(fù)制[31-33]。最后，通過(guò)病毒拷貝數(shù)檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)重組蛋白NSP5可促進(jìn)RV的復(fù)制[34-36]。

因此，本研究成功構(gòu)建pEGFP-N2-NSP5重組質(zhì)粒并初步探討了攜帶EGFP的NSP5的重組質(zhì)粒能夠用于RV復(fù)制過(guò)程示蹤及調(diào)控機(jī)制研究，為后續(xù)更加深入地探究NSP5功能、NSP5與非編碼RNA調(diào)控機(jī)制及RV治療策略打下基礎(chǔ)。