鐵皮石斛氨基酸通透酶基因(DoAAP2)的克隆及表達分析

劉楚琪， 胡 睿， 王萬軍

(西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031)

氮是植物生長發育所必需的一種礦物營養物質，在植物的生命活動中起重要作用[1]。土壤氮分為無機氮和有機氮，表土中90%的氮以有機氮形式存在，其中氨基酸態氮所占比例達20%～40%[2]。氨基酸是蛋白質的基本組成部分，在新陳代謝、細胞結構、生長發育等方面起重要作用[3]。在植物中，氨基酸對提高其產量、改善產品品質、增強植株抗逆性及保護生態環境等方面發揮著重要的作用[4]。研究表明，植物對氨基酸的吸收主要是協同運輸，需要載體、能量共同完成，受溫度、pH值、土壤類型的影響，吸收動力學符合米氏方程[5-6]。氨基酸轉運蛋白是高等植物中介導氨基酸跨細胞膜轉運的一種完整的膜蛋白，在植物生長發育的各個過程中起著不可或缺的作用，包括長距離的氨基酸轉運、對病原體的響應和非生物脅迫等[7]，不同部位的氨基酸轉運蛋白對植物的生命活動有不同的影響，如葉的發育、果莢和種子的數量等。氨基酸轉運蛋白主要包括氨基酸多胺膽堿轉運蛋白超家族(Amino acid-polyamine-choline transporter superfamily, APC)和氨基酸/生長素滲透酶超家族(amino acid/auxin permease superfamily, AAAP)。APC超家族包括陽離子氨基酸轉運蛋白(cationic amino acid transporters, CATs)，L-型氨基酸轉運蛋白(L-type amino acid transporters, LATs)；AAAP家族包括氨基酸通透酶家族(amino acid permease, AAPs)，賴氨酸和組氨酸轉運蛋白(lysine histidine-like transporters, LHTs), 脯氨酸轉運蛋白(proline transporters, ProTs)，生長素轉運蛋白(auxin-resistant, AUXs)，氨基丁酸轉運體(γ-aminobutyric acid transporters, GATs)，芳香族和中性氨基酸轉運蛋白(ANT1-like aromatic and neutral amino acid transporters, ANTs)6個亞家族[8-10]。其中，對氨基酸通透酶參與多種生命活動的研究最為廣泛[11]。AAPs的相對分子質量相差不大，一般含有475～496個氨基酸，并且都含有一個典型的Aa trans(氨基酸轉運)結構域[12]，具有特異性和親和力。目前，氨基酸通透酶在擬南芥、玉米、水稻等植物中都有所研究，但在蘭科植物鐵皮石斛研究較少。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有滋陰清熱、益胃生津等功效。由于其特殊的生長發育機制被廣泛研究[13-14]。鐵皮石斛中含有豐富的氨基酸，研究表明，不同產地、部位、生理年齡對其氨基酸含量都有所影響[15-17]。本文以鐵皮石斛為試驗材料，通過cDNA末端快速擴增(Rapid - amplification of cDNA ends, RACE)技術對DoAAP2進行克隆，并對該基因在鐵皮石斛不同組織及生長發育不同階段進行表達分析，結合生物信息學分析，推測該基因在鐵皮石斛生長發育過程的功能及表達模式，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛的種子來源于云南，接種于不含激素的1/2MS培養基上，在室溫25 ℃，光照16 h/d的條件下無菌培養，經原球莖發育為完整植株。

選取單株長約6 cm，具有5～6片葉的鐵皮石斛新鮮幼苗，取其根、莖、葉各100 mg。另外選取鐵皮石斛成熟種子以及培養過程中處于種胚活化期(P1)、原球莖形成期(P2)、原分生組織形成期(P3)、頂端分生組織形成期(P4)、橢球形原球莖期(P5)、葉原基維管系統形成期(P6)、根端分生組織形成期(P7) 共 7 個時期的原球莖各100 mg。

以上樣品經液氮速凍后放入-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛總RNA提取及cDNA的合成

取上述凍存樣品，使用植物RNA提取試劑盒Plant RNA Kit對各試驗材料進行總RNA提取，試劑盒購于Omega BIO-TEK公司，用RNase-freeDNaseI (TaKaRa公司) 去除總RNA中的基因組污染。所提取的RNA經1% 瓊脂糖凝膠電泳及OD260/OD280值檢測，要求具有清晰的28S rRNA和18S rRNA條帶、無彌散條帶且OD260/OD280為1.8～2.1。選取符合要求的RNA為逆轉錄材料，采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) 試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，用于后續的基因克隆及熒光定量PCR。

1.2.2DoAAP2基因克隆及測序

根據實驗室已獲得的鐵皮石斛轉錄組序列采用primer premier5.0設計DoAAP2的3′巢式PCR引物(表1)并交由上海生工公司合成。以cDNA為模板進行目的基因的擴增。

PCR反應體系：EasyTaqDNA Polymerase 0.15 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 19.35 μL、dNTPmix 1 μL、EasyTaqbuffer 2.5 μL，總體系為25 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃再延伸5 min。

PCR產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用膠回收試劑盒(公司)回收，連接至pGEM-T easy載體，重組質粒轉化至大腸桿菌DH5a，經藍白斑篩選及菌液PCR后送至上海生物工程公司進行測序，測序結果經NCBI比對。根據測序所得的序列設計qRT-PCR引物用于實時熒光定量 PCR 實驗(表1)。

表1 DoAAP2克隆引物及qRT-PCR所用引物

1.2.3 生物信息學分析

將所得核酸序列用BioXM2.6進行開放閱讀框的查找并將其翻譯為蛋白序列。

運用NCBI上的BLAST (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 檢索近緣物種的基因序列信息，通過DNAMAN進行比對分析；利用PSORT Prediction (http://pso-rt.hgc.jp/form.html)對DoAAP進行亞細胞定位預測；利用SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html) 分析蛋白質序列二級結構；利用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dt-u.dk/services/TMHMM-2.0/) 預測DoAAP2的跨膜區；利用Signal 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析蛋白質信號肽；利用ProtParam分析DoAAP2的基本理化性質；利用GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析DoAAP2完整CDS序列和全基因組序列。

1.2.4 構建DoAAP2基因編碼氨基酸序列的系統發育樹

以DoAAP2基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進行blastp搜索，選取相似性≥71%的不同物種序列，共38條。采用ClustalX軟件進行序列比對，采用MEGA6.0構建系統發育樹。

1.2.5 熒光定量PCR分析

根據熒光定量PCR引物設計原則，使用Primer Primer 5. 0對DoAAP2設計定量引物，另選用鐵皮石斛的管家基因DoActinl(β-actin,β-肌動蛋白) 和DoGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內參基因，引物序列見表1所示，送至上海生工公司合成。

熒光定量PCR反應體系：2×T5 Fast qPCR Mix (Probe) 12.5 μL、Rorword primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL，總體系為25 μL，試劑購于北京擎科新業生物技術有限公司。

熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，40個循環；溶解；冷卻。

每一樣本設立3組技術重復，3組生物學重復。誤差分析采用LightCycler? 96 SW 1.1 軟件；相對表達量分析采用2-ΔΔCt分析方法。

2 結果與分析

2.1 DoAAP2基因的克隆及序列分析

圖1 DoAAP2 PCR 擴增結果

利用氨基酸通透酶基因特異引物，通過3′-RACE克隆獲得了一條長925 bp的3′-端序列(圖1)，與鐵皮石斛基因組CDS數據庫中的DoAAP序列比對并拼接后得到一條長度為1722 bp的DoAAP基因序列，且在其3′-端具有一個含17個A的poly (A) 尾，根據NCBI Blastn比對情況將之命名為DoAAP2，拼接后序列的3′-端和5′-端各有一個非編碼區，分別由87個和143個核苷酸組成。利用BioXM軟件分析，該基因開放閱讀框(ORF)長度為1490 bp，編碼496個氨基酸殘基(圖2)。通過Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/) 分析該基因所編碼的蛋白序列，確定該蛋白具有完整的Aa trans(氨基酸轉運)結構域，共437個氨基酸，位于47～484位氨基酸殘基。通過NCBI blastp分析，選取與DoAAP2相似性最高的13種不同物種的AAP序列進行多序列比對(圖3)，經分析發現該蛋白在結構域內保守性高，結構域如圖3紅色線框所示，證明該蛋白確為氨基酸通透酶(AAPs)。

圖2 DoAAP2的核酸序列與氨基酸序列

圖3 多物種氨基酸序列比對

通過Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析DoAAP2基因的完整CDS序列和全基因組序列，結果顯示DoAAP2基因共含有6個外顯子和5個內含子(圖4-A)。

2.2 DoAAP2的生物信息學分析

通過ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 預測所得，DoAAP2所編碼的蛋白共有493個氨基酸，分子式為C2519H3860N606O677S24，相對分子質量為54 235.45 u，理論等電點(pI)為8.57；所帶的負電荷(Asp+Glu)總數為30，正電荷(Arg+Lys)總數為35，則該蛋白帶正電荷；不穩定系數為36.71，表明該蛋白為穩定蛋白。

A：DoAAP2基因結構，B：DoAAP2跨膜結構預測；C：DoAAP2信號肽預測；D：DoAAP2 蛋白質二級結構預測

通過TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預測DoAAP2共有9個跨膜區(圖4-B)，證明該蛋白與跨膜轉運相關。

通過SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測該蛋白不含信號肽(圖4-C)。

通過SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl page=npsa_so- pma.html) 預測DoAAP2蛋白的二級結構，結果顯示該蛋白α-螺旋的比例為45.03%，β-折疊的比例為3.04%，延伸鏈的比例為17.24%，無規卷曲的比例為34.9%(圖4-D)。

通過PSORT Prediction (http://psort1.hgc.jp/form.html) 對蛋白DoAAP2進行亞細胞定位，結果顯示該蛋白主要存在于細胞質膜、葉綠體類囊體膜、高爾基體、內質網上，可能性分別為：60%、42.4%、40%和30%。推斷該蛋白可能與氨基酸的吸收和轉運及植物的光合作用有關。

2.3 DoAAP2蛋白的系統進化樹分析

將DoAAP2的氨基酸序列與已選取的38條不同物種相似性高的序列通過ClustalX比對后，利用Mega6.0構建進化樹。結果如圖5所示，不同植物的AAPs共可分為3部分，記為A、B、C 3組。其中DoAAP2所在的A組全為單子葉植物，B、C兩組親緣關系較近，且全為雙子葉植物。DoAAP2與PeAAP3親緣關系最近，這符合鐵皮石斛與小蘭與蝴蝶蘭同屬蘭科單子葉植物的特征。

圖5 不同物種AAP蛋白系統發育分析

2.4 DoAAP2在不同組織及原球莖發育不同時期的基因表達分析

利用qRT-PCR技術對DoAAP2進行分析，以采用2-△△Ct方法對原始Ct值進行計算后得出DoAAP2基因的相對表達量。DoAAP2在鐵皮石斛不同組織中表達有所差異(圖6)，在根、莖、葉中表達量相對較高，其中，DoAAP2在葉的表達量最高，約是根的2.37倍；而在愈傷組織中的表達量極低，僅為根的表達量的1%。

R、St、L、C分別代表鐵皮石斛根、莖、葉、愈傷組織

DoAAP2在鐵皮石斛原球莖發育的不同時期表達量也有所不同，以原球莖形成時期(P2)為基準，分別測定了種胚活化期(P1)，原分生組織形成(P3)，頂端分生組織(P4)，橢球形原球莖時期(P5)、葉原基維管系統形成(P6)和根端分生組織形成(P7)共7個時期以及類原球莖的相對表達量。結果如圖7所示，DoAAP2在鐵皮石斛原球莖發育前6個時期的表達量呈先上升后下降的趨勢，在原分生組織形成時期達到頂峰，約為原球莖形成時期的2.26倍，在橢球形原球莖時期和葉原基維管系統形成時期表達量較低，相比原球莖形成時期分別下降了68.2%和81.9%；另外，DoAAP2在根端分生組織形成時期表達量驟升，約為原球莖形成時期表達量的1.64倍，而在類原球莖時期表達量又有所下降，相比原球莖形成時期下降了68.5%。

P1-P7分別代表鐵皮石斛種胚活化期，原球莖形成，原分生組織形成，頂端分生組織形成，橢球形原球莖時期、葉原基維管系統形成和根端分生組織形成時期；PLBs代表類原球莖時期

3 討論

氨基酸通透酶(AAP)是植物中重要的氨基酸轉運蛋白，在氨基酸吸收、轉運等方面具有重要作用。本研究針對鐵皮石斛DoAAP2的結構、功能及表達進行分析。

生物信息學分析表明，DoAAP2開放閱讀框(ORF)長度為1482 bp，編碼493個氨基酸，含有完整的Aa trans結構域，具有6個外顯子和5個內含子。DoAAP2所編碼的蛋白含有9個跨膜區，與其為跨膜轉運蛋白相關；生物信息學預測其亞細胞定位于細胞質膜、葉綠體類囊體膜、高爾基體、內質網上，推斷該蛋白可能與氨基酸的吸收和轉運及植物的光合作用有關。

多序列比對顯示，DoAAP2在結構域內保守性高。系統發育分析顯示該蛋白與同為蘭科的小蘭嶼蝴蝶蘭、深圳擬蘭同源性最高，另與鳳梨、油棕、海藻、高粱、短柄草等11種植物同屬一個分支，構成A群，這些植物的共同特征為同為單子葉植物。

氨基酸在植物中作為前體化合物存在于蛋白質合成及多個代謝途徑中，如激素、木質素合成[18]。氨基酸通透酶作為氨基酸的轉運載體在植物各個組織及生長各個時期都起著重要的作用。目前AAPs在擬南芥中的研究最為廣泛，AtAAP1在根部表達，轉運土壤中的谷氨酸、組氨酸和中性氨基酸[19]，另外，AtAAP1還在種子中表達量高，具有調控胚乳吸收氨基酸的功能[20]。AtAAP8同樣在種子中表達[21]，該基因突變體的結實率降低了約50%[22]；AtAAP3主要在根的維管束組織中表達，可能具有從韌皮部吸收氨基酸或從土壤中轉運氨基酸的功能[23]；AtAAP2、AtAAP6分別在韌皮部、木質部中表達[24-25]，AtAAP5在擬南芥的各個組織中都有所表達[26]，在根系吸收氨基酸方面起重要作用[27]。Taylor等[28]從水稻中鑒定出19個氨基酸通透酶(AAP)基因，其中，OsAAP1在種子中表達量最高，轉運中性及帶正電荷的氨基酸；OsAAP3在水稻的所有器官中都有所表達，其中根的表達量最高，并且具有明顯的底物特異性，能轉運賴氨酸和精氨酸，但對芳香族氨基酸具有選擇性；OsAAP7以及OsAAP16作為普通氨基酸通透酶，與擬南芥AAPs的功能類似。AAPs在豌豆、蠶豆、玉米、楊樹等植物中也有所研究，都表明AAPs在植物生長發育中發揮的重要作用[29-31]。

DoAAP2在鐵皮石斛不同組織及原球莖發育各個階段均有表達。在各組織中，DoAAP2在莖和葉中表達量較高，結合生物信息學預測其亞細胞定位于葉綠體類囊體膜，推測該蛋白可能與植物的光合作用，特別是光反應有關，具有為植物體提供能量、有機物等重要物質的作用。DoAAP2在原球莖發育時期均有表達，表明該基因對原球莖的形態發生有著非常重要的作用；在原球莖形成初期活化種胚，在原球莖發育成苗的過程中，如原分生組織形成(P3)、頂端分生組織形成(P4)、根端分生組織形成(P7)時期表達量較高，表明該基因對鐵皮石斛根、莖的發育起重要作用。另外，DoAAP2在體胚誘導的類原球莖中表達較低，表明類原球莖形態雖與原球莖相似，但基因表達有所差異，發育過程也不盡相同。