3 種不同品種沙棘葉中沒食子酸含量的測定

張 欣，張雪娟，王小莉，郭海利，姚 瑩，張小民

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名黑刺、醋柳、酸刺等，屬于薔薇目胡頹子科沙棘屬，落葉灌喬木。在我國，沙棘主要分布于山西、陜西、甘肅、青海、內蒙古、河北等地[1]。據報道[2]，沙棘屬植物有7 個種11 個亞種，而我國含有7 個種（柳葉沙棘、沙棘、肋果沙棘、棱果沙棘、西藏沙棘、理塘沙棘、江孜沙棘）和7 個亞種（云南沙棘亞種、臥龍沙棘亞種、蒙古沙棘亞種、中亞沙棘亞種、中國沙棘亞種、江孜沙棘亞種、密毛肋果沙棘亞種）。山西省分布的野生沙棘全部為中國沙棘[3]，2011 年水利部在太谷縣設立了沙棘新品種試驗基地種植沙棘新品種，阜雜1 號和雜優54 號于2012 年引自水利部鄂爾多斯沙棘種植基地。近年來，對沙棘的研究主要集中在沙棘結構[4-5]和沙棘果油籽油的開發[6-7]，對沙棘葉的研究較少，沙棘中多酚類化合物主要以沒食子酸為母核[8]。沒食子酸又稱五倍子酸，其化學名稱為3，4，5- 三羥基苯甲酸，廣泛存在于各種植物中，是化學結構最簡單的天然多酚類化合物[9]。沒食子酸具有保護心血管的作用，如抗高血壓、抗心肌梗死、抗血管鈣化；還具有保護神經系統、抗糖尿病和抗肝纖維化作用[9]。此外，沒食子酸還對腫瘤細胞（如胰腺癌、肺癌、前列腺癌、皮膚癌、白血病、胃癌等）有殺傷作用[10-14]。因此，對沒食子酸的研究具有廣闊的應用前景。

沙棘多酚的測定方法多采用比色法，其準確度較低，且少有人測定沒食子酸的含量。

本研究采用高效液相色譜法，測定比較了山西中國沙棘以及水利部推廣的新品種沙棘阜雜1 號和雜優54 號的沒食子酸含量，旨在為沙棘葉的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試沙棘品種為中國沙棘、阜雜1 號和雜優54 號，其中，中國沙棘為山西省野生品種；阜雜1號和雜優54 號種植于山西省太谷縣任村鄉郝村水利部沙棘新品種試驗基地。

1.2 試驗儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC-2030C3D）；昆山超聲波清洗機（KQ-500DE）；超純水機（密理博SimplicityUV）；電子分析天平（梅特勒XSE205DU）。

沒食子酸標準品采自國家標準物質網（CAS149-91-7）；水為超純水（超純水機制備）；甲醇為高效液相色譜級；其他試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為AmethystC18-11（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶0.1%磷酸（15∶85）；柱溫為30 ℃；流速為1.00 mL/min；檢測波長為273 nm，進樣量為20 μL。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 標準品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇，溶解稀釋至刻度后搖勻，作為對照品溶液，溶液濃度為1.125 g/L，備用。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取沙棘葉粉末1 g，置于50 mL 容量瓶中，加50 mL 甲醇溶解，超聲提取1 h（功率500 W，頻率40 kHz），待溶液冷卻至室溫后，甲醇補足減失的量，搖勻；用0.22 μm的有機微孔濾膜過濾，取濾液，即為供試樣品。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸對照品的HPLC 分析

在1.3.1 色譜條件下測得沒食子酸標準品的HPLC圖如圖1 所示，沒食子酸出峰時間為6.290min。

2.2 線性關系的考察

精密吸取沒食子酸對照品溶液5，10，15，20，30，40，60 μg/mL，在1.3.1 色譜條件下，注入高效液相色譜儀中，測定其峰值。以沒食子酸的進樣量（x，μg/mL）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，得到回歸線方程y＝41 165.3x-123 188（n＝7，R2＝0.998 1），結果如圖2 所示，表明對照品沒食子酸進樣量為5～60 μg/mL 時，與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗

在1.3.1 色譜條件下，取30 μg/mL 沒食子酸標準溶液20 μL，連續進樣5 次，結果測得沒食子酸峰面積的RSD 為1.02%（n＝5），說明該儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗

在1.3.1 色譜條件下，于0，2，4，8，12 h 測得沒食子酸峰面積RSD 值為1.11%（n＝5），說明在12 h內沒食子酸穩定性良好。

2.5 重復性試驗

在1.3.1 色譜條件下，取6 份中國沙棘葉供試品，分別進樣，測得沒食子酸峰面積RSD 值為1.28%（n＝6），說明該方法重現性良好。

2.6 回收率試驗

精密稱取已知含量的供試品5 份，每份約0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，再分別精密加入0.5 mL 質量濃度為1.125 g/L 的沒食子酸標準品，按照1.3.2.2方法制備5 份供試品溶液，在1.3.1 色譜條件下進行檢測，測得結果如表1 所示，結果顯示，回收率平均為97.42%，RSD 值為0.42%。說明該試驗沒食子酸的加標回收率符合要求。

表1 沙棘葉沒食子酸回收率測定結果

2.7 樣品含量測定

按照1.3.2.2 方法制得供試品，在1.3.1 色譜條件下測定不同品種沙棘葉中沒食子酸的含量，由表2 可知，沙棘葉中沒食子酸的含量由大到小依次為中國沙棘＞雜優54 號＞阜雜1 號。

表2 不同品種沙棘葉中沒食子酸含量測定 mg/g

3 結論與討論

本試驗利用高效液相色譜儀測定不同品種的沙棘葉中沒食子酸的含量。取沙棘葉粉末，用甲醇在超聲波輔助下提取1 h，再經0.22 μm 的有機微孔濾膜過濾后，利用高效液相色譜法測定不同品種的沙棘葉中沒食子酸的含量。結果表明，沒食子酸的進樣量為5～60 μg/mL 時與峰面積呈良好線性關系，且中國沙棘葉中的沒食子酸含量最多，雜優54 號次之，阜雜1 號沒食子酸含量最少。阜雜1 號和雜優54 號沙棘早熟，果大且多，色澤鮮艷，口感較好；中國沙棘雖然晚熟果的口感酸澀，但其葉的營養成分含量優于阜雜1 號和雜優54 號，二者在利用價值上各有利弊。牟丹等[15]采用比色法，以沒食子酸為標準品測得青海地區沙棘葉中總多酚的含量為（15.34±1.88）mg/L，與本試驗結果存在差異，可能是由于提取條件不同。敬思群[16]以沒食子酸為標品，采取分光光度法測得沙棘葉中多酚提取液的吸光度為7.385 mg/g，所測含量比本試驗結果高，可能是由于測定方法不同。

山西省的野生沙棘面積居于我國首位[17]，其資源豐富，開發利用前景廣闊，目前我國對沙棘的開發利用主要為沙棘果和沙棘葉，其中，沙棘果的開發主要包括沙棘籽油、沙棘果油、沙棘汁等，沙棘葉的開發主要為沙棘茶[18]。根據前人的研究結果，沙棘葉中除了沒食子酸外還含有大量蘆丁以及科羅索酸[19-20]，且沒食子酸對多種癌細胞都有抑制作用。周菲菲等[21]研究結果表明，增強Caspase-3 表達誘導卵巢癌SKOV3 細胞凋亡；羅強等[22]研究結果表明，沒食子酸通過上調p53 基因表達、下調Bcl-2基因表達，誘導Hela 細胞凋亡；王瑩等[10]研究認為，沒食子酸可能通過線粒體信號傳導途徑誘導人胰腺癌MIA Paca-2 細胞凋亡；ISHIHARA 等[23]研究表明，沒食子酸對人白血病細胞（HK-63）活性具有一定的抑制作用；沒食子酸還被證實能降低人肺腺癌細胞（PC-14）和人胃腺癌細胞（MKN45）等人類癌細胞系的存活率[24]。沙棘葉中含有大量的沒食子酸，表明其具有抗癌作用。沙棘在抗癌藥的開發方面具有廣闊前景。