驢腹瀉源大腸桿菌的耐藥性分析

王國(guó)艷，李燕平，孫樂(lè)天，王志宇，牛曉燕，任克良

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.太原動(dòng)物園，山西太原030009）

大腸桿菌廣泛存在于自然界中，是條件致病菌，通常情況下作為腸道常在菌被人們所知，但是在環(huán)境、飼料、水源、熱等應(yīng)激條件下，可引起畜禽腸道病變，誘發(fā)腹瀉[1-4]等疾病，給畜牧業(yè)帶來(lái)一定的損失。

2018 年11 月初，山西省太原市婁煩縣某驢養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)急性腹瀉，臨床上表現(xiàn)為臥地不起、精神萎靡、食欲不振、軟便[3-5]，發(fā)病1 d，無(wú)死亡。

本研究對(duì)山西省太原市婁煩縣某驢養(yǎng)殖場(chǎng)的26 頭腹瀉驢的糞樣進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)，共分離出26 株大腸桿菌，采用K-B 紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行敏感藥物篩選試驗(yàn)，旨在為該驢場(chǎng)臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源 山西省太原市婁煩縣某驢養(yǎng)殖場(chǎng)26 頭腹瀉驢的肛拭子26 份，在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 生化試驗(yàn)管：乳糖、麥芽糖等各類糖發(fā)酵管、尿素、V-P 試驗(yàn)生化管、甘露醇、吲哚試驗(yàn)生化管等，均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯以及鑒別培養(yǎng)基（麥康凱和伊紅美藍(lán)），均購(gòu)自青島賓得生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備 奧林巴斯顯微鏡、滅菌壓力鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈操作臺(tái)、數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 在無(wú)菌環(huán)境中，將采集的棉拭子管中分別加入5 mL 的肉湯培養(yǎng)液，37 ℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，觀察肉湯濁度；再劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，24 h 后，挑取單個(gè)菌落接種于麥康凱上，24 h 后，再挑取單個(gè)粉紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑取伊紅美藍(lán)上的疑似單個(gè)菌落，接種在LB 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，備用；蘸取肉湯液，劃線接種于伊紅美藍(lán)上，恒溫37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取單個(gè)菌落進(jìn)行染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 用接種針?lè)謩e蘸取肉湯菌液穿刺接種于甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、尿素、V-P 試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等生化管中，恒溫37 ℃培養(yǎng)18～36 h。

1.2.3 耐藥性試驗(yàn) 采用K-B 紙片擴(kuò)散法對(duì)青霉素、鏈霉素，頭孢類藥物頭孢克羅、頭孢曲松、頭孢哌酮，阿米卡星、諾氟沙星、多黏菌素B、痢特靈、卡那霉素、氧氟沙星、慶大霉素、阿莫西林等13 種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后量取抑菌圈直徑，計(jì)算耐藥率。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似病原菌的分離鑒定結(jié)果

肉湯管中呈渾濁且有沉淀；在普通瓊脂平板生長(zhǎng)的單個(gè)菌落以乳白色光滑菌落生長(zhǎng)；麥康凱平板上有單個(gè)菌落呈粉紅色或磚紅色不透明的光滑的圓形菌落生長(zhǎng)；伊紅美藍(lán)平板上有單個(gè)菌落呈深紫黑色生長(zhǎng)。革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓、較細(xì)的、單個(gè)排列的桿狀菌，符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性，初步共分離出疑似大腸桿菌菌株26 株。

2.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

26 株分離株均發(fā)酵甘露醇、乳糖、麥芽糖等糖類，且均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解尿素，V-P 試驗(yàn)均為陰性，吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性，鑒定均為大腸桿菌，符合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的大腸桿菌生化特性。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

表1 26 株驢腹瀉源大腸桿菌對(duì)13 種藥物的耐藥情況

依據(jù)美國(guó)NCCLS 制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷，即抑菌圈直徑（mm）≥20 mm為高度敏感，16 mm＜直徑＜20 mm為中度敏感，直徑≤16 mm 為耐藥。敏感藥物篩選結(jié)果顯示，分離的26 株驢腹瀉源大腸桿菌對(duì)青霉素和多黏菌素B 的耐藥率高達(dá)95%以上，對(duì)青霉素更是達(dá)到了完全絕對(duì)耐藥；對(duì)痢特靈和頭孢克羅的耐藥率分別為38.46%和23.08%；對(duì)卡那霉素的耐藥率較低，為3.85%；對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢曲松絕對(duì)高敏（表1）。

3 結(jié)論與討論

本研究初步認(rèn)定，試驗(yàn)分離出26 株驢腹瀉源大腸桿菌，分離率為100%，而大腸桿菌被認(rèn)為是引起畜禽腹瀉的主要病原菌之一，推測(cè)其是引起該驢場(chǎng)腹瀉的優(yōu)勢(shì)菌株。

本研究表明，分離出的26 株大腸桿菌除了對(duì)多黏菌素B 的耐藥率高達(dá)96.51%，這與孫瑩慧等[6]報(bào)道的2017 年分離得到的不明地區(qū)的驢內(nèi)臟型大腸桿菌僅對(duì)多黏菌素B 敏感和李雙雙等[7]在2013 年報(bào)道的兔源大腸桿菌對(duì)多黏菌素B 的高敏相反，這可能因菌株出現(xiàn)的年代、區(qū)域不同，而存在差異，也可能與菌株分離得到的部位有關(guān)，內(nèi)臟型[8]大腸桿菌與腸道型大腸桿菌的差異性有待研究；對(duì)青霉素的絕對(duì)耐藥，與張莉莉等[9]報(bào)道的2016 年甘肅部分地區(qū)奶牛乳房炎源大腸桿菌對(duì)青霉素的耐藥率在99%以上相近，與王禮偉等[10]對(duì)新疆石河子地區(qū)的奶牛乳房炎源大腸桿菌耐藥研究中對(duì)青霉素完全耐藥相同，這可能與青霉素在養(yǎng)殖業(yè)中長(zhǎng)期不規(guī)范使用有關(guān)，與地域、菌株分離部位無(wú)關(guān)；對(duì)卡那霉素的耐藥率較低，為3.85%，這與王國(guó)艷等[11]2018 年報(bào)道的山西省兔腹瀉源大腸桿菌對(duì)卡那霉素的耐藥率幾乎相同，這表明2018 年山西地區(qū)驢和兔的腹瀉源大腸桿菌對(duì)卡那霉素的耐藥性幾乎相同，說(shuō)明同一地區(qū)、同一年度、同一飼養(yǎng)規(guī)模程度的不同物種，腹瀉源大腸桿菌對(duì)卡那霉素的耐藥性相同。兔和驢都屬于特種養(yǎng)殖，在山西地區(qū)屬于養(yǎng)殖起步階段；驢腹瀉源大腸桿菌對(duì)阿米卡星的耐藥率為0，這與王志宇等[12]報(bào)道的山西省雞源內(nèi)臟型大腸桿菌對(duì)阿米卡星的高耐藥率不同，這表明在不同養(yǎng)殖規(guī)模、不同養(yǎng)殖發(fā)展程度的養(yǎng)殖過(guò)程中，不同來(lái)源的大腸桿菌對(duì)同一藥物的耐藥性不同。

大腸桿菌的致病機(jī)制和耐藥機(jī)制比較復(fù)雜[13-15]，因地域、時(shí)間、來(lái)源的不同而存在一定的差異，本研究結(jié)果僅對(duì)該驢場(chǎng)此次疫病臨床用藥有指導(dǎo)意義，不具有廣泛代表性。